5.2. Analyse des huiles essentielles

L'isolement des huiles essentielles par hydrodistillation a été réalisé dans un appareil de type Clevenger pendant 3h [64].

Le glycoside de cistanche peut également augmenter l'activité de la SOD dans les tissus cardiaques et hépatiques et réduire considérablement la teneur en lipofuscine et en MDA dans chaque tissu, piégeant efficacement divers radicaux réactifs de l'oxygène (OH-, H₂O₂, etc.) et protégeant contre les dommages à l'ADN causés par des radicaux OH. Les glycosides phényléthanoïdes de Cistanche ont une forte capacité de piégeage des radicaux libres, une capacité de réduction supérieure à la vitamine C, améliorent l'activité de la SOD dans la suspension de sperme, réduisent la teneur en MDA et ont un certain effet protecteur sur la fonction de la membrane du sperme. Les polysaccharides Cistanche peuvent améliorer l'activité de la SOD et du GSH-Px dans les érythrocytes et les tissus pulmonaires de souris sénescentes expérimentalement causées par le D-galactose, ainsi que réduire la teneur en MDA et en collagène dans les poumons et le plasma et augmenter la teneur en élastine, ont un bon effet de piégeage sur le DPPH, prolonge le temps d'hypoxie chez les souris sénescentes, améliore l'activité de la SOD dans le sérum et retarde la dégénérescence physiologique du poumon chez les souris expérimentalement sénescentes Avec la dégénérescence morphologique cellulaire, des expériences ont montré que Cistanche a la bonne capacité antioxydante et a le potentiel d'être un médicament pour prévenir et traiter les maladies du vieillissement cutané. Dans le même temps, l'échinacoside dans Cistanche a une capacité significative à piéger les radicaux libres DPPH et peut piéger les espèces réactives de l'oxygène, empêcher la dégradation du collagène induite par les radicaux libres et a également un bon effet réparateur sur les dommages causés par les anions des radicaux libres thymine.

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Les analyses des huiles ont été réalisées à la fois par chromatographie en phase gazeuse (GC) et chromatographie en phase gazeuse/spectrométrie de masse (GC/MS). Les analyses GC ont été effectuées à l'aide d'un chromatographe en phase gazeuse (Agilent 7890A, Palo Alto, Californie, États-Unis), équipé d'un diamètre intérieur de 30 m × 00,25 mm avec un diamètre fixe de 0,25 µm colonne capillaire HP -5 d'épaisseur de film (Agilent J&W, Santa Clara, Californie, États-Unis). Le programme de température suivant a été utilisé : de 60 ◦C à 246 ◦C à une vitesse de 3 ◦C min-1 puis maintenu à 246 ◦C pendant 20 min (temps total d'analyse 82 min). Les autres conditions opératoires étaient les suivantes : gaz vecteur hélium (pureté supérieure ou égale à 99,9999 % — Air Liquide, Milan, Italie) ; débit, 1,0 mL.min−1 ; température de l'injecteur, 250 ◦C ; température du détecteur, 300 ◦C. L'injection de 1 µL d'échantillon dilué (1:100 dans du n-hexane, p/p) a été réalisée avec un rapport de division de 1:20, à l'aide d'un échantillonneur automatique (Agilent, modèle 7683B, Santa Clara, Californie, États-Unis).

Les analyses GC-MS ont été effectuées à l'aide d'un chromatographe en phase gazeuse (Agilent 6890N, Santa Clara, Californie, États-Unis) équipé d'un diamètre intérieur de 30 m × 0,25 mm avec une épaisseur de film stationnaire de 0,25 µm HP{ {7}}colonne capillaire ms (Agilent J&W, Santa Clara, CA, USA) couplée à un détecteur sélectif de masse doté d'un dispositif d'ionisation d'électrons, EI, et d'un analyseur quadripolaire (Agilent 5973, Santa Clara, CA, USA). Le programme de température et les conditions de fonctionnement chromatographiques (à l'exception du détecteur) étaient les mêmes que ceux utilisés pour le GC-FID. Les conditions MS étaient les suivantes : température de la ligne de transfert MS 240 ◦C ; Température de la source d'ions EI, 200 ◦C avec une énergie d'ionisation de 70 eV ; température quadripolaire 150 ◦C; vitesse de balayage, 3,2 balayages.s-1 à la plage de balayage m/z, (30 à 480). Pour manipuler et traiter les chromatogrammes et les spectres de masse, le logiciel MSD ChemStation a été utilisé (Agilent, rév. E.01.00.237, Santa Clara, CA, USA). Les composés ont été identifiés par comparaison de leurs spectres de masse avec ceux des données de la bibliothèque NIST02 du système GC/MS et des bibliothèques Adams [32,33]. Les résultats ont en outre été confirmés par la comparaison de l'ordre d'élution des composés avec leurs indices de rétention sur les phases semi-polaires rapportés dans la littérature [32]. Les indices de rétention des composants ont été déterminés par rapport aux temps de rétention d'une série de n-alcanes (deux mélanges standards C8-C20 et C21-C40) avec interpolation linéaire [65]. Le pourcentage de composants individuels a été calculé sur la base des zones de pic GC sans correction du facteur de réponse FID. Les résultats sont présentés sous forme de pourcentage de pics individuels ± écart type de deux analyses chromatographiques indépendantes.

5.3. Activité antifongique

L'activité antifongique de l'huile essentielle de S. cacaliifolia a été évaluée contre les champignons filamenteux et les levures. Trois souches cliniques de dermatophytes isolées des ongles et de la peau (Epidermophyton floccosum FF9, Trichophyton mentagrophytes FF7 et Microsporum canis FF1) et quatre souches de type dermatophyte de la Colección Espanõla de Cultivos Tipo (T. mentagrophytes var. interdigital CECT 2958, T. rubrum CECT 2794, T. verrucosum CECT 2992 et M. gypseum CECT 2908), une souche de type Cryptococcus neoformans (C. neoformans YPO186), deux souches cliniques de Candida isolées de cas récurrents de vulvovaginal (C. krusei LF33, C. guillermondii MAT23) et trois souches de type Candida (C. albicans ATCC 10231, C. tropicalis YPO128 et C. paraphimosis ATCC 90018). Toutes les souches ont été stockées dans un bouillon de dextrose Sabouraud avec 20% de glycérol à -80 ◦C et sous-cultivées dans de la gélose Sabouraud dextrose (SDA) ou de la gélose dextrose à la pomme de terre (PDA) avant chaque test, pour garantir des conditions de croissance et une pureté optimales.

Une méthode de bouillon de microdilution a été utilisée pour déterminer les concentrations minimales inhibitrices (MIC) et la concentration minimale létale (MLC) de l'huile selon le protocole de référence du Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M38-A2 [66] ou M27-A3 [67] pour les champignons filamenteux et les levures, respectivement. La CMI était la concentration la plus faible à laquelle aucune croissance n'a été observée dans les tubes à essai inoculés, tandis que la MLC était la concentration la plus faible à laquelle aucune croissance n'a été observée après inoculation dans du SDA de tous les tubes négatifs. Un contrôle négatif (milieu non inoculé) et un contrôle positif (milieu inoculé avec 1 % de DMSO) ont également été inclus.

5.4. Activité anti-inflammatoire

RAW 264.7, une lignée cellulaire de macrophages leucémiques de souris obtenue auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC TIB-71), a été cultivée comme précédemment rapporté par notre groupe [22].

La production de NO a été mesurée en quantifiant l'accumulation de nitrites dans les surnageants de culture, en utilisant le réactif de Griess [68]. Les cellules (0.6 × 106 cellules/puits) ont été cultivées dans des plaques de culture 48-puits. Après une nuit de stabilisation, les macrophages ont été prétraités pendant 1 h avec l'huile essentielle (0.08–1,25 µL/mL) diluée dans du DMSO puis activés avec 50 ng/mL de LPS pour 24h. Des témoins positifs (macrophages stimulés par le LPS) et négatifs (macrophages non traités) ont été réalisés. Après cette période d'incubation, des volumes égaux de surnageants de culture et de réactif de Griess [1:1 de dichlorhydrate de N-(1-naphtyl) éthylènediamine à 0,1 % (p/v) et de sulphanilamide à 1 % (p/v) contenant 5 % ( w/v) H3PO4] ont été mélangés et incubés pendant 30 min, dans l'obscurité. L'absorbance à 550 nm a été enregistrée dans un lecteur de plaque automatisé (Agilent, Santa Clara, CA, USA) et la concentration de nitrite a été déterminée à partir d'une courbe standard de nitrite de sodium. Le DMSO à la concentration maximale utilisée (0,4 %) a déjà été démontré par notre groupe comme étant dépourvu d'effets anti-inflammatoires et de cytotoxicité (données non présentées).

RAW 264.7 (1,2 × 106 cellules/puits) a été cultivé dans des plaques 6-puits et laissé se stabiliser pendant 12 h. Ensuite, les cellules ont été incubées avec l'huile essentielle (0,64 µL/mL) pendant 1 h suivie d'une activation du LPS (50 ng/mL) pendant 24 h. Un contrôle négatif (cellules non traitées) et un contrôle positif (cellules traitées au LPS uniquement) ont été considérés. Les lysats cellulaires ont été préparés comme décrit précédemment par Zuzarte et al. [22].

Une analyse Western blot a été effectuée pour mesurer les niveaux de protéines de l'oxyde nitrique synthase inductible (iNOS) et de la cyclooxygénase{{0}} (COX-2). Les protéines ont été séparées par électrophorèse sur SDS-polyacrylamide 10 % (v/v), à 130 V pendant 1,5 h, et transférées sur des membranes de fluorure de polyvinylidène (préalablement activées avec du méthanol) à 400 mA pendant 3 h. Après avoir bloqué les IgG non spécifiques avec du lait à 5 % (p/v) dans du TBS-T pendant 1 h à température ambiante, les membranes ont été incubées avec des anticorps spécifiques contre iNOS (1:500 ; R & D Systems) ou COX{{15} } (1:5000 ; Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) pendant la nuit, à 4 ◦ C. Ensuite, les membranes ont été lavées pendant 30 min avec du TBS-T (10 min, 3 fois) et incubées à température ambiante, pendant 1 h, avec des anticorps secondaires (1:40,000 ; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX , USA) conjugué à la peroxydase de raifort. Les complexes immuns ont été détectés à l'aide d'un scanner à chimiluminescence (Image Quant LAS 500, GE, Boston, MA, USA). Les membranes ont été sondées avec un anticorps anti-tubuline (1:20 000; Sigma) pour garantir qu'une quantité équivalente de protéine a été chargée. La quantification des protéines a été réalisée à l'aide d'ImageLab version 6.1.0 (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA).

5.5. Migration cellulaire

NIH 3T3, une lignée cellulaire de fibroblastes embryonnaires de souris (ATCC CRL -1658), a été cultivée comme décrit précédemment dans notre groupe [69].

5.5.2. Test de migration cellulaire

La migration cellulaire a été effectuée à l'aide du test de la plaie par égratignure, tel que rapporté par Martinotti et ses collègues [70] avec de légères modifications. En bref, des fibroblastes NIH 3T3 ont été ensemencés à 2, 5 × 105 cellules / ml dans des plaques à puits 12-. Après 24 h de croissance, une rayure a été réalisée dans la monocouche cellulaire à l'aide d'un embout de pipette de 20 à 200 µL. Les cellules détachées ont été éliminées en lavant les cellules avec du PBS stérile 1x. Du DMEM avec 2% de sérum a été ajouté à toutes les plaques, en présence ou en l'absence d'huile essentielle. À l'aide d'un microscope à contrat de phase, les images ont été acquises 0, 12 et 18 h après le grattage, et la zone de la plaie a été mesurée à l'aide du logiciel ImageJ/Fiji. Les résultats présentés ont été obtenus à l'aide de l'équation suivante

5.6. Viabilité cellulaire

L'effet de différentes concentrations de l'huile essentielle sur la viabilité des macrophages et des fibroblastes a été réalisé à l'aide du test de réduction de la résazurine. En bref, des macrophages ({{0}}.6 × 106 cellules/mL) ou des fibroblastes (1,25 × 105 cellules/mL) ont été ensemencés dans des plaques 48-puits. Après une nuit de stabilisation, différentes concentrations d'huile essentielle (0,08–1,25 µL/mL) diluées dans du DMSO ont été ajoutées pendant 24 h. À la fin de l'expérience, le milieu a été retiré et du milieu frais contenant de la résazurine (1:10) a été ajouté pendant 1 h ou 4 h, pour les macrophages et les fibroblastes, respectivement. L'absorbance à 570 nm avec un filtre de référence de 620 nm a été enregistrée dans un lecteur de plaque automatisé (Agilent, Santa Clara, CA, USA). La viabilité cellulaire a été déterminée à l'aide de l'équation suivante :

où AbsExp est l'absorbance (différence entre 570 et 620 nm) dans les différentes conditions expérimentales et AbsCT est l'absorbance dans les cellules témoins (pas d'huile essentielle).

5.7. Sénescence induite par l'étoposide 

La sénescence a été évaluée à l'aide d'un kit de coloration à la bêta-galactosidase disponible dans le commerce selon le protocole du fabricant (Cell Signaling Technology). En bref, 2, 5 × 104 fibroblastes ont été ensemencés dans des plaques à puits 12- et ont permis une adhérence pendant la nuit. Ensuite, la sénescence a été induite en incubant les cellules avec 12,5 µM d'étoposide pendant 24 h. L'étoposide a été éliminé et les cellules ont été lavées avec du PBS 1x. Ensuite, les cellules ont été laissées récupérer pendant 72 h dans du DMEM en l'absence ou en présence d'huile essentielle de S. cacaliifolia, et les changements de morphologie ont été évalués quotidiennement. Après 72 h, les cellules ont été fixées pendant 15 min à l'aide d'une solution de fixateur 1x (fournie dans le kit commercial), suivies de lavages au PBS, et incubées pendant une nuit avec une solution de coloration à la bêta-galactosidase dans un incubateur sec à 37 ◦C sans apport de CO2. Différents champs ont été visualisés au microscope pour le développement de la couleur bleue et ont été photographiés pour l'analyse d'image (8 images par condition). Une coloration bleue distincte était indicative de l'activité bêta-galactosidase. L'analyse quantitative a été effectuée à l'aide d'ImageJ et le pourcentage de cellules sénescentes par rapport aux cellules totales a été calculé.

5.8. Analyses statistiques

Les résultats sont présentés sous forme de valeurs moyennes ± SEM (erreur standard de la moyenne) d'au moins trois expériences indépendantes réalisées en double. La signification statistique des tests anti-inflammatoires, de viabilité cellulaire et de sénescence a été déterminée à l'aide d'une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) suivie du test post-hoc de Dunnett à l'aide de GraphPad Prism version 9.3.0 (GraphPad Software, San Diego, Californie, États-Unis). Pour les tests de migration cellulaire, la signification statistique a été déterminée par ANOVA à deux voies suivie du test de comparaison multiple de Sydák. Une valeur de p <0.05 a été considérée comme représentant des différences significatives.

Contributions d'auteur:Conceptualisation, LS et AM ; validation, AS, MJG, MTC et SP ; analyse formelle, JMA-S., MJG, AP et DF ; enquête, JMA-S., AM et AP ; ressources, AM, EC, MTC et LS ; conservation des données, AP ; rédaction—préparation du projet original, JMA-S., AP et AM ; rédaction—révision et édition, MTC, LS et AM ; visualisation, JMA-S.; supervision, LS et AM ; gestion de projet, LS ; acquisition de financement, LS et MTC Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.

Financement:Ce travail a été financé par COMPETE 2020—Programme opérationnel pour la compétitivité et l'internationalisation et les fonds nationaux portugais via FCT—Fundação para a Ciência ea Tecnologia, dans le cadre des projets UIDB/04539/2020, UIDP/04539/2020 et LA/P/0058/2020.

Déclaration de disponibilité des données :Les données seront disponibles sur demande.

Les conflits d'intérêts:Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.

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