Développement d'une huile enrichie en polyphénols extraits des eaux usées des moulins à huile, partie 1

Abstrait:L'extraction de l'huile d'olive produit d'importantes eaux usées résiduelles des moulins à huile (OMW). La composition de l'OMW varie selon le type d'olive, le niveau de maturité du fruit et la méthode d'extraction (système traditionnel à une pression ou systèmes continus basés sur la centrifugation de la pulpe d'olive). Dans les pays producteurs d'olives, l'OMW est important pour l'environnement et l'économie et constitue également une source peu coûteuse de composés polyphénoliques aux propriétés antioxydantes élevées. Les propriétés de l'huile d'olive, telles que ses effets anti-athérogéniques, anti-inflammatoires, anti-âge et modulateurs immunologiques, ont été attribuées à ses polyphénols. Dans cette étude, la méthode d'extraction du point de trouble (CPE) a été utilisée pour récupérer les composés polyphénoliques des OMW. La phase micellaire totale des trois récupérations était de 24,2 % et les polyphénols totaux (après sonication) étaient de 504 mg GAE/Kg. De plus, l'ajout de polyphénols récupérés à partir d'OMW a amélioré l'huile d'olive et prolongé sa durée de conservation sans modifier ses propriétés organoleptiques. Il y avait un changement de 42,2 % dans les polyphénols après un enrichissement de 0,5 % des dispersions micellaires. Ainsi, il est suggéré que la méthode CPE pourrait conduire à une meilleure gestion des déchets dans l'industrie de l'huile d'olive et améliorer la qualité nutritionnelle des produits alimentaires.

Le glycoside de cistanche peut également augmenter l'activité de la SOD dans les tissus cardiaques et hépatiques et réduire considérablement la teneur en lipofuscine et en MDA dans chaque tissu, piégeant efficacement divers radicaux réactifs de l'oxygène (OH-, H₂O₂, etc.) et protégeant contre les dommages à l'ADN causés par des radicaux OH. Les glycosides phényléthanoïdes de Cistanche ont une forte capacité de piégeage des radicaux libres, une capacité de réduction supérieure à la vitamine C, améliorent l'activité de la SOD dans la suspension de sperme, réduisent la teneur en MDA et ont un certain effet protecteur sur la fonction de la membrane du sperme. Les polysaccharides Cistanche peuvent améliorer l'activité de la SOD et du GSH-Px dans les érythrocytes et les tissus pulmonaires de souris sénescentes expérimentalement causées par le D-galactose, ainsi que réduire la teneur en MDA et en collagène dans les poumons et le plasma et augmenter la teneur en élastine, ont un bon effet de piégeage sur le DPPH, prolonge le temps d'hypoxie chez les souris sénescentes, améliore l'activité de la SOD dans le sérum et retarde la dégénérescence physiologique du poumon chez les souris expérimentalement sénescentes Avec la dégénérescence morphologique cellulaire, des expériences ont montré que Cistanche a la bonne capacité antioxydante et a le potentiel d'être un médicament pour prévenir et traiter les maladies du vieillissement cutané. Dans le même temps, l'échinacoside dans Cistanche a une capacité significative à piéger les radicaux libres DPPH et peut piéger les espèces réactives de l'oxygène, empêcher la dégradation du collagène induite par les radicaux libres et a également un bon effet réparateur sur les dommages causés par les anions des radicaux libres thymine.

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Mots clés: antioxydants; extraction des points de trouble ; industrie alimentaire; enrichissement; eaux usées des moulins à huile; huile d'olive; polyphénols; récupération

1. Introduction

La demande d'huile d'olive ne cesse d'augmenter dans le monde. Dans la région méditerranéenne, qui est la plus grande région productrice d'olives au monde, une énorme quantité d'eaux usées agro-industrielles est générée par l'industrie de transformation des olives [1,2]. Les résidus d'eaux usées des moulins à huile (OMW) sont composés de déchets solides - constitués de pulpe d'olive - ainsi que de déchets liquides - constitués de légumes et d'eau supplémentaire générée lors de la décantation. L'OMW a une couleur brun foncé (qui peut devenir noire) et un arôme distinctif et puissant qui rappelle les olives [3]. Les sous-produits des moulins à huile ont une importance environnementale et économique dans les pays producteurs d'olives. L'OMW crée des niveaux élevés de polluants en raison de sa charge organique élevée et d'une teneur élevée en substances polyphénoliques phytotoxiques et antibactériennes, qui résistent à la dégradation biologique [4]. Le traitement et l'élimination des OMW deviennent un problème environnemental sérieux. Ainsi, les pays producteurs d'huile d'olive ont été confrontés à un sérieux défi pour trouver une solution respectueuse de l'environnement et économiquement viable à la manipulation et à l'élimination des OMW.

Une technologie innovante et respectueuse de l'environnement pour extraire les substances bioactives, en particulier des aliments, est l'extraction au point de trouble (CPE). C'est une technique où les composants chimiques ou biologiques sont extraits à l'aide de tensioactifs non ioniques qui, lorsqu'ils sont chauffés à (ou au-dessus) d'une température critique, ont tendance à se séparer de la solution en vrac et à créer des nuages ​​[5]. Les tensioactifs sont spécifiquement utilisés comme extractants au cours du processus CPE. Dans les bonnes circonstances, l'extraction a lieu à une température inférieure au point de trouble - lorsque le tensioactif devient trouble (c'est-à-dire moins soluble que l'échantillon initial ou même insoluble) - conduisant à la séparation de deux phases : la phase aqueuse et le tensioactif -phase riche. En raison des processus de trouble, la technique conduit à une préconcentration des analytes (tels que les polyphénols) dans la phase riche en tensioactifs [6]. De plus, il a été démontré que les composés solubilisés par la micelle étaient protégés de l'oxydation [7].

Les composés polyphénoliques, les sucres et les acides organiques constituent la majorité des OMW. L'OMW possède également de riches ressources telles que le potassium et d'autres nutriments minéraux, qui peuvent être réutilisés comme engrais [8]. Cependant, l'OMW pourrait être une source naturelle d'antioxydants en raison de sa forte teneur en composés polyphénoliques. Les polyphénols d'huile d'olive ont des propriétés nutritionnelles potentiellement bénéfiques pour leurs activités antioxydantes et biologiques telles que les propriétés anti-allergiques, anti-inflammatoires, anticancéreuses et anti-hypertensives [9,10]. Le faible potentiel redox des polyphénols, qui leur permet d'agir comme agents réducteurs en donnant de l'hydrogène ou des électrons et en piégeant les radicaux libres, est à la base de leur activité antioxydante [7].

Les producteurs de pétrole visent à produire des produits alimentaires qui conservent leur valeur nutritionnelle et leur durée de conservation sur une longue période. Ces facteurs font de la supplémentation en antioxydants une technique courante pour réduire l'oxydation des lipides dans la production alimentaire [11]. Pour prévenir l'oxydation dans les aliments contenant des graisses et des huiles, des antioxydants synthétiques, notamment le butylhydroxytoluène (BHT), la tert-butylhydroquinone (TBHQ) et le butylhydroxyanisole (BHA), ont été utilisés comme additifs alimentaires. Cependant, il a été révélé que ces antioxydants chimiques ont été liés à une variété de risques pour la santé, y compris le cancer et la carcinogenèse [12].

Des recherches récentes ont montré que les antioxydants naturels peuvent empêcher l'oxydation des huiles comestibles [11-13]. L'enrichissement de l'huile d'olive en substances polyphénoliques permet d'augmenter la durée de conservation de l'huile d'olive sans affecter ses caractéristiques organoleptiques. Cependant, l'équilibre antioxydant/pro-oxydant dépend de nombreux facteurs, en particulier la dose (par exemple, la concentration) et le moment (par exemple, la durée de stockage) et c'est un processus très délicat qui peut facilement être modifié [14]. Par conséquent, la récupération des composés polyphénoliques offre non seulement une opportunité économique mais réduit également la charge environnementale des eaux usées.

Les objectifs de cette étude étaient d'une part de récupérer les substances polyphénoliques de l'OMW avec l'application de la méthode CPE, et d'autre part d'enrichir l'huile d'olive avec les substances polyphénoliques récupérées. La stabilité des polyphénols est un paramètre important dans cet enrichissement. Des émulsifiants, comme la lécithine, ont été étudiés à cette fin.

2. Matériels et méthodes

2.1. Matériaux

Dans cette enquête, un échantillon d'eaux usées de moulins à huile (Olea europaea var. Koroneiki) de la région de Preveza (Épire, Grèce) a été utilisé. L'échantillon OMW a été spécifiquement collecté par l'industrie de l'huile d'olive, congelé et livré à notre laboratoire le même jour. L'huile d'olive d'un marché local à Karditsa (Thessalie, Grèce) a été utilisée comme matrice pour l'échantillon de contrôle, composé d'huiles d'olive vierges et raffinées.

2.2. Réactifs

The 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH• ) and α-tocopherol were purchased from Alfa Aesar (Karlsruhe, Germany). Sodium chloride, citric acid, lecithin of soya (>97 pour cent), l'éther diéthylique et l'isooctane ont été obtenus auprès de Carlo Erba (Milan, Italie). Le carbonate de sodium anhydre et l'hydroxyde de sodium provenaient de Penta (Prague, République tchèque). L'éthanol absolu, le méthanol, le réactif de Folin-Ciocalteu et l'acide gallique monohydraté provenaient de Panreac (Barcelone, Espagne). Le cyclohexane et le n-hexane provenaient de Sigma-Aldrich (Steinheim, Allemagne). L'eau désionisée utilisée dans les expériences a été produite à l'aide d'une colonne de désionisation.

2.3. Extraction de polyphénols à partir d'OMW

Une méthode appelée extraction du point de trouble (CPE) a été utilisée. La méthode CPE est basée sur la notion que lorsque la concentration d'un tensioactif dans une solution dépasse celle de la dispersion micellaire critique, il peut générer des dispersions micellaires [6]. La figure 1 montre les étapes expérimentales de la méthode CPE. Tout d'abord, l'échantillon devait être décongelé avant que les solides puissent être séparés à l'aide d'une centrifugeuse (Digicen 20-R, Orto Alresa, Madrid, Espagne) pendant 10 min à 4 500 tr/min. Après avoir récupéré le surnageant, de l'acide citrique (50 %) a été ajouté pour amener le niveau de pH à 3,5. L'échantillon entier a été divisé en trois portions, avec de la lécithine comme tensioactif ajoutée à chacune d'elles à des concentrations de 1 %, 3 % et 5 %, respectivement, avec 30 % de sel. Un agitateur magnétique intense a été utilisé pour l'agitation. Après 20 min, la solution a été centrifugée pendant 5 min à 4500 tr/min. La phase micellaire supérieure (tensioactif) (SP) et la phase aqueuse inférieure (eau) (WP) ont été examinées séparément. La première récupération des dispersions polyphénoliques s'est produite à ce stade. Avec la phase aqueuse contenant les analytes non extraits, la méthode CPE a été effectuée deux fois de plus dans les mêmes conditions (2ème et 3ème récupération). Foods 2023, 12, x FOR PEER REVIEW 3 of 13 L'éthanol absolu, le méthanol, le réactif Folin–Ciocalteu et l'acide gallique monohydraté provenaient de Panreac (Barcelone, Espagne). Le cyclohexane et le n‐hexane provenaient de Sigma‐Aldrich (Steinheim, Allemagne). L'eau désionisée utilisée dans les expériences a été produite à l'aide d'une colonne de désionisation

2.4. Détermination des performances de la méthode CPE

2.4.1. Teneur totale en polyphénols

Selon Chatzilazarou et al. [15], la méthode de Folin-Ciocalteu a été utilisée pour déterminer la teneur totale en polyphénols (TPC) par photométrie. En bref, 0.5 g de dispersions micellaires et 0.5 mL de réactif de Folin-Ciocalteu ont été ajoutés à une fiole jaugée de 25- mL. Après 3 minutes, 1 mL de Na2CO3 (35 %, p/p) a été ajouté. De l'eau déminéralisée a été utilisée pour remplir les flacons au niveau de volume nécessaire, et ils ont ensuite été maintenus dans l'obscurité pendant 60 min. Un spectrophotomètre Shimadzu UV-1700 UV/Vis (Kyoto, Japon) a été utilisé pour mesurer l'absorption à 750 nm. Des solutions standard (1 à 10 mg/L) ont été utilisées pour créer une courbe d'acide gallique standard. Le TPC a été exprimé en mg d'équivalents d'acide gallique (GAE) par kg de dispersions micellaires.

La méthode DPPH de Katsoyannos et al. [16], avec quelques modifications, a été utilisé pour évaluer l'activité anti-radicalaire des polyphénols extraits dans la phase tensioactive ainsi que ceux encore présents dans l'échantillon suite au traitement CPE (phase eau). En bref, une solution de 1 mL, 0.1 mM de DPPH méthanolique a été ajoutée à 4 mL de la solution d'échantillon (500, 1000 et 2000 mg/L). Le mélange a été soigneusement secoué avant d'être laissé reposer à température ambiante dans l'obscurité pendant 30 min tandis que l'absorbance était mesurée à 517 nm. La formule utilisée pour déterminer le pourcentage d'inhibition était la suivante : pourcentage d'inhibition=100 × (Acontrôle - Aéchantillon)/Acontrôle, où Acontrôle et Aéchantillon sont les absorbances. À partir des activités de piégeage (pourcentage) par rapport aux concentrations de la courbe d'échantillon correspondante, la CI50 a été déterminée.

2.5. Enrichissement de l'huile d'olive avec des dispersions micellaires

À l'aide d'une sonde à ultrasons (Misonix Sonicator S3000, Qsonica, LLC, Newtown, CT, États-Unis) et d'un protocole de sonication (75 % d'énergie électrique pendant 60, 75 et 90 min avec 0,5 impulsion cycles), la réduction de la taille micellaire a été étudiée. La méthode CPE a été utilisée pour récupérer des dispersions micellaires, qui ont ensuite été ajoutées à l'huile d'olive pour l'améliorer. Pour l'enrichissement, des concentrations de 0,5, 1 et 5 % ont été utilisées.

2.6. Analyse de la qualité de l'huile d'olive enrichie

Conformément au règlement (CEE) n° 2568/91 de la Commission [17], la méthode de dosage des acides gras libres (AGL) dans l'huile d'olive a été mise au point.

2.6.2. Indice de réfraction 

Un réfractomètre (réfractomètre Quartz/Digital Abbe, Medline Scientific Limited, Oxon, Royaume-Uni) a été utilisé pour mesurer l'indice de réfraction de l'échantillon. L'instrument a été calibré avec de l'eau distillée, qui avait un indice de réfraction de 1,3333 à 20 ◦C.

2.6.3. Colorimétrie

Le colorimètre a été utilisé pour déterminer la couleur des échantillons d'huile d'olive (Lovibond CAM-System 500, The Tintometer Ltd., Amesbury, UK). Pour déterminer la couleur CIELAB, un échantillon (25 ml) a été placé dans un bécher de 50 ml et placé dans le colorimètre. Un indice psychométrique de luminosité, L*, et des coordonnées de chrominance, a* et b*, ont été définis. De plus, la formule de calcul de la chrominance, ou C*, était la suivante : C*=[(a*)2 plus (b*)2 ] 1/2 .

2.6.4. Enquête spectrophotométrique dans l'ultraviolet

À l'aide d'un spectrophotomètre, la méthode d'investigation spectrophotométrique ultraviolette a été réalisée conformément au règlement d'exécution n° 299/2013 de la Commission [18].

2.6.5. Méthode Rancimat

Selon Lalas et al. [19], la méthode Rancimat a été utilisée pour tester la stabilité à l'oxydation des échantillons d'huile d'olive. Plus précisément, les récipients de réaction du Rancimat 743 (Metrhom LTD, Herisau, Suisse) ont été remplis avec environ 3 g de chaque huile d'olive. Les paramètres choisis étaient une température de 90 ◦C et un débit d'air de 15 L/h. Le moment où le taux d'oxydation change rapidement et produit un fort point d'inflexion sur la courbe d'oxydation est connu sous le nom de temps d'induction, et il est représenté par la valeur de l'indice de stabilité de l'huile d'olive. Il s'agissait de la période d'induction (IP), qui était exprimée en heures. De plus, cette formule a été utilisée pour calculer le facteur de protection (PF) : PF=(IP avec antioxydant)/(IP sans antioxydant). L'inhibition de l'oxydation des lipides est indiquée par un facteur de protection supérieur à un, et l'activité antioxydante est améliorée par une valeur PF plus élevée.

2.6.6. Calorimétrie à balayage différentiel

La calorimétrie différentielle à balayage (DSC) mesure les températures et les flux de chaleur associés aux transitions dans les matériaux en fonction du temps et de la température. Ces mesures comprennent des données quantitatives et qualitatives sur les changements physiques et chimiques impliquant des processus endothermiques ou exothermiques, ainsi que des modifications de la capacité calorifique. La DSC a été utilisée dans cette enquête pour évaluer la stabilité oxydative de l'huile [20]. Un plateau spécial en aluminium a été utilisé pour peser 5 mg ± 0,5 mg d'huile. Un plateau vierge (référence) a également été ajouté. Le débit d'oxygène était de 20 ml/min et les conditions oxydatives ont été programmées au Diamond DSC (PerkinElmer Inc., Shelton, CT, USA). L'échantillon et la référence ont été placés sur le DSC, et le thermogramme a été lancé à 40 ◦C pendant 1 min, suivi de 300 ◦C à une vitesse de 10 ◦C/min. La température de début du pic d'oxydation (Tmax) détermine la température de début d'oxydation.

2.6.7. Extraction des composés polyphénoliques des huiles d'olive enrichies

L'extraction des polyphénols des huiles d'olive a été réalisée comme décrit par Kalantzakis et al. [21]. Des échantillons d'huile d'olive (1 g) ont été dissous dans 2 ml de n-hexane et 2 ml d'une solution méthanol/eau 60:40 (v/v). La solution finale a été centrifugée à 4500 tr/min pendant 5 min après une agitation vigoureuse. La fraction soluble dans le méthanol/eau (polaire) des échantillons d'huile d'olive a été obtenue et utilisée telle quelle.

2.6.8. Teneur totale en polyphénols

Comme mentionné précédemment, la teneur totale en polyphénols (TPC) a été déterminée à l'aide de la méthode de Folin-Ciocalteu. Le TPC a été exprimé en mg d'équivalents d'acide gallique (GAE) par kg d'huile d'olive.

2.6.9. Activité anti-radicalaire

La méthode DPPH, comme mentionné précédemment, a été utilisée pour évaluer l'activité de piégeage des radicaux des polyphénols extraits des échantillons d'huile d'olive. La capacité à piéger le radical DPPH a été exprimée en pourcentage d'inhibition et la CI50 a été calculée à partir des activités de piégeage (pourcentage) par rapport aux concentrations de la courbe d'échantillon correspondante.

2.7. Analyses statistiques

Les résultats sont donnés pour la moyenne et l'écart-type (ET) de trois essais contemporains. À l'aide du progiciel statistique IBM SPSS Statistics (version 26) (SPSS Inc., Chicago, IL, États-Unis), une ANOVA unidirectionnelle a été effectuée pour déterminer s'il existait des différences statistiquement significatives entre les valeurs moyennes. Un niveau significatif de p < 0.05 a été utilisé.

3. Résultats et discussion

3.1. Récupération des Polyphénols

Une phase aqueuse de concentration de lécithine a été réalisée, où la même procédure a été utilisée pour récupérer les polyphénols. En raison de la faible concentration de lécithine de 1 %, aucune micelle de tensioactif n'a été produite. D'autre part, lorsqu'il y avait une concentration élevée de 5 % de lécithine, cela réduisait leur solubilité dans l'eau et entraînait la formation de deux phases. La température d'équilibrage (45 ◦C) et la teneur en sel (30 pour cent) étaient constantes (troisième récupération). La phase micellaire totale des trois récupérations est exprimée à l'aide de la colonne Total SP (Figure 2).

De plus, des procédures de sonication (75 % d'énergie électrique pendant 60, 75 et 90 min avec un cycle d'impulsion de 0,5) avec une sonde à ultrasons ont été utilisées pour examiner la réduction de la taille des micelles. Enfin, 0,5 % des dispersions de polyphénols récupérés par la méthode CPE ont été ajoutés à l'huile pour l'améliorer. Ce résultat peut être expliqué par Víctor-Ortega et al. [22], qui ont constaté que la solubilisation des composés phénoliques sur les micelles de surfactant devenait saturée à des concentrations de surfactant plus élevées et que la rétention des polyphénols diminuait. De plus, selon Sliwa et Sliwa [23], lorsque la concentration en tensioactif est inférieure à la concentration micellaire critique (CMC), la solubilité de la substance active est faible.

Dans Katsoyannos et al. [24] étude, lorsque 6 pour cent de surfactant Triton X‐114 ont été appliqués, la technique CPE dans OMW (après l'élimination des composés gras) a produit des récupérations supérieures à 60 pour cent. Dans une autre étude, Gortzi et al. [25], ont montré qu'en utilisant un CPE simple et ultérieur, la récupération totale de phénol à partir d'OMW avec différentes concentrations de Genapol X‐080 (2, 5 et 20 %, v/v) atteignait jusqu'à 89,5 %. De plus, Katsoyannos et al. [16], ont utilisé un CPE en double étape avec 5 % plus 5 % de Tween 80 pour récupérer jusqu'à 94,4 % des phénols totaux de l'OMW. Enfin, dans Alibade et al. [6], la lécithine était utilisée comme tensioactif tandis que le CPE était utilisé pour récupérer les composés phénoliques des boues de vinification (WSL). Les phases riches en tensioactifs ont montré une forte activité antioxydante. Leurs découvertes montrent que le CPE et la lécithine peuvent être utilisés pour séparer avec succès les polyphénols du WSL.

3.2. Enrichissement de l'huile d'olive avec des polyphénols à partir d'eaux usées d'huile d'olive

Une altération des propriétés organoleptiques des dispersions micellaires a été observée après 0,5 % d'enrichissement p/v (turbidité). Cette modification a conduit à la sélection finale d'un enrichissement en lécithine de 3 %. Pour obtenir de meilleurs résultats, la première récupération a été combinée avec les deuxième et troisième. De plus, la sonication s'est avérée efficace pour réduire les dispersions micellaires. Le système d'huile a répondu négativement à des quantités de 1 % et 5 %. Après quelques heures d'enrichissement, le précipité a été observé dans les échantillons d'huile.

L'échantillon initial a été soumis à la méthode CPE, qui a fait chuter la concentration en polyphénols de 3448 mg à 346 mg GAE/Kg (Figure 3). Au niveau moléculaire, la diminution du nombre de liaisons hydrogène entre les polyphénols et l'eau a permis l'incorporation de polyphénols dans la micelle au détriment de sa solubilisation [26]. Les micelles ont ensuite été traitées par sonication et méthanol pour extraire les polyphénols, augmentant la teneur en polyphénols à 1562 mg GAE/Kg. La concentration finale en polyphénols était de 504 mg GAE/Kg (après sonication), ce qui démontre qu'une diminution de la dispersion micellaire entraîne une baisse de la concentration en polyphénols totaux [27]. De plus, la durée prolongée des ultrasons provoque la dissolution des particules dans le solvant, ce qui réduit la valeur TPC [28].

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