Les exosomes urinaires identifient les voies inflammatoires dans les lésions rénales aiguës associées à la vancomycine

Contact:joanna.jia@wecistanche.com/ Whatsapp : 008618081934791

Linda Awdishu 1,*, Amy Le 1, Jordan Amato 1, Vidhyut Jani 1, Soma Bal 2, Robert H. Mills 1, Marvic Carrillo-Terrazas 1, David J. Gonzalez 1, Ashita Tolwani 3, Anjali Acharya 4, Jorge Cerda 5, Melanie S. Joy 6,7, Paola Nicoletti 8, Etienne Macedo 2, Sucheta Vaingankar 2, Ravindra Mehta 2, Satish P. Ramachandra Rao 9 et au nom des enquêteurs directs †

1 Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Université de Californie, San Diego, CA 92093, États-Unis ;a6le@ucsd.edu (AL) ; jegilmor@ucsd.edu (JA); vgjani@ucsd.edu (VJ); rhmills@health.ucsd.edu (RHM);mac215@health.ucsd.edu (MC-T.); djgonzalez@ucsd.edu (DJG)

2 École de médecine, Université de Californie, San Diego, CA 92093, États-Unis ; sobal@ucsd.edu (SB) ;emacedo@ucsd.edu (EM) ; svaingankar@health.ucsd.edu (SV); rmehta@ucsd.edu (MR)

3 School of Medicine, University of Alabama, Birmingham, AL 35233, USA; atolwani@uab.edu

4 Albert Einstein College of Medicine, The Bronx, NY 10461, USA; anjali2526@gmail.com

5 Collège médical d'Albany, Albany, NY 12208, États-Unis ; jorge.cerda82@gmail.com

6 Division des maladies rénales et de l'hypertension, Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical, Aurora, CO 80045, États-Unis ; MELANIE.JOY@cuanschutz.edu

7 École de médecine, Université du Colorado, Aurora, CO 80045, États-Unis

8 École de médecine Mount Sinai, New York, NY 10029, États-Unis ; paola.nicoletti@mssm.edu

9 Département de médecine cellulaire et moléculaire, Système médical de l'Université du Michigan, Ann Arbor, MI 48109, États-Unis ; satishpr@med.umich.edu

* Correspondance : lawdishu@ucsd.edu ; Tél. : plus 858-534-3919

† La composition des enquêteurs directs est indiquée dans les remerciements.

Résumé:

Arrière plan:La vancomycine est couramment utilisée comme traitement de première ligne pour les organismes gram-positifs tels que le Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline. Aiguë induite par la vancomycineun reinblessure(V-AKI) a été signalé chez jusqu'à 43 % des patients, en particulier chez ceux dont les concentrations minimales ciblées étaient plus élevées. Le mécanisme précis de la blessure chez l'homme reste insaisissable, avec des preuves récentes dirigées vers l'apoptose des cellules du tubule proximal. Dans cette étude, nous avons étudié le contenu en protéines des exosomes urinaires chez les patients atteints de V-AKI afin d'élucider davantage les biomarqueurs des mécanismes de blessure et les réponses potentielles. Méthodes : Des échantillons d'urine de patients atteints d'IRA-V qui étaient inscrits à l'étude DIRECT et des témoins sains appariés de l'UAB-UCSD O'Brien CenterBiorepository ont été inclus dans l'analyse. Les exosomes ont été extraits en utilisant le principe d'exclusion de solvant et la précipitation induite par le polyéthylène glycol. L'identité et la quantification des protéines ont été déterminées par chromatographie liquide sans étiquette-spectrométrie de masse (LC/MS). Le pic moyen de créatinine sérique était de 3,7 ± 1,4 mg/dL et le tempsun reinblessureétait de 4,0 ± 3,0 jours. À la sortie, 90 % des patients ont démontré une récupération partielle ; 33 pour cent ont connu une récupération complète au jour 28. Les analyses protéomiques sur cinq échantillons de V-AKI et 7 échantillons de contrôle ont révélé 2009 protéines dans tous les échantillons et 251 protéines significativement associées au V-AKI (Pi-score > 1). Les principales protéines discriminantes étaient le complémentC3, le complément C4, la protéine de liaison à la galectine-3-, le fibrinogène, l'alpha-2 macroglobuline, l'immunoglobuline lourde constante mu et la sérotransferrine.

Conclusion:Les exosomes urinaires révèlent une régulation à la hausse des protéines in-inflammatoires après une lésion néphrotoxique dans V-AKI. D'autres études sont nécessaires pour un grand échantillon de patients afin de confirmer ces résultats pour l'élucidation des mécanismes physiopathologiques et la validation des biomarqueurs de blessures potentiels.

Mots clés:vancomycine; AKI; néphrotoxicité; exosomes; inflammation; complément; voies immunitaires

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1. Introduction

La vancomycine est un antibiotique glycopeptidique utilisé pour le traitement des infections à Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline chez les patients gravement malades. La néphrotoxicité est un événement indésirable grave affectant 10 à 20 % des patients traités et est associée à une augmentation de la durée du séjour à l'hôpital, des 30-taux de réadmission à l'hôpital de jour et de la mortalité toutes causes confondues 30-jour [1]. Aiguë associée à la vancomycineun reinblessure(V-AKI) est lié à la dose et avec un début de traitement de 4 à 17 jours. Bien que le V-AKI soit reconnu depuis longtemps comme un effet secondaire majeur de la vancomycine, les mécanismes de la néphrotoxicité sont restés mal compris. La compréhension des réponses cellulaires et moléculaires déclenchées par la vancomycine est d'une importance capitale pour comprendre les mécanismes et développer des stratégies pour minimiser le risque de V AKI et les coûts associés tout en maximisant son efficacité dans le traitement des infections. La réponse rénale toxique semble être causée par un effet direct de la vancomycine sur l'épithélium des tubules proximaux [2]. À ce jour, des approches toxicogénomiques standard ont été appliquées pour étudier V-AKI dans des modèles murins, mais les études humaines font défaut [3–5]. Des modèles animaux démontrent que l'administration de vancomycine induit un stress oxydatif qui peut contribuer à des lésions rénales [6,7]. Un mécanisme possible de lésion est le piégeage du médicament dans les cellules tubulaires proximales puisqu'il est transporté par les transporteurs de cations organiques (OCT) à travers la membrane basolatérale et dans la cellule du tubule proximal, mais aucun mécanisme actif de transport d'efflux n'a été identifié [6 –8].

Les exosomes sont des vésicules microcytaires dérivées de la membrane qui jouent un rôle clé dans la communication intercellulaire et l'apport de protéines/acides nucléiques et offrent la possibilité de découvrir de nouveaux biomarqueurs pour faciliter le diagnostic clinique deun reinblessure[9]. Il a été proposé que les exosomes aient une plus grande spécificité et sensibilité pour la découverte de biomarqueurs, attribuée à la stabilité des échantillons par rapport aux approches transcriptomiques et protéomiques utilisant des échantillons de sérum et d'urine conventionnels [9]. Dans cette étude, nous avons testé l'hypothèse selon laquelle la modification des protéines de l'exosome urinaire en réponse à V-AKI aide à élucider les mécanismes de la lésion et à identifier de nouveaux biomarqueurs chez les patients présentant une lésion rénale d'origine médicamenteuse confirmée. Pour cela, nous avons employé des sujets de l'étude Drug-Induced Renal Injury Consortium (DIRECT), qui est une cohorte internationale et multicentrique de cas cliniquement jugés d'affections aiguës induites par des médicaments.un reinblessureet des contrôles basés sur la population pour examiner les prédicteurs pharmacogénomiques à l'aide d'une association à l'échelle du génome. Les détails de l'étude DIRECT sont décrits dans la section Méthodes et une publication récente de notre laboratoire [10].

2. Résultats

Des échantillons d'urine de 22 sujets, 10 cas de V-AKI et 12 témoins ont été inclus dans les analyses. Les données démographiques des patients étaient similaires entre les cas de V-AKI et les témoins et sont résumées dans le tableau 1. Comme prévu, la prévalence de l'hypertension, du diabète et de l'insuffisance cardiaque était plus élevée chez les cas de V-AKI que chez les témoins (tableau 1).

Tous les cas d'IRA-V ont développé une IRA de stade 2 ou plus selon les critères KDIGO (Kinney Disease Improving Global Outcomes) (Figure 1) [11]. L'apparition de la V-AKI s'est produite 4,0 ± 3,0 jours après l'initiation de la vancomycine. L'évolution temporelle des variations de la créatinine sérique (Scr) entre l'admission à l'hôpital et la sortie de l'hôpital, et par la suite, est illustrée à la figure 1.

Figure 1. Modifications de la créatinine sérique par rapport au cours V-AKI. Cette figure illustre les changements de la créatinine sérique dans 10 cas au cours d'une infection aiguë associée à la vancomycine.un reinblessurede l'admission à l'hôpital jusqu'au jour 90 après la blessure. Les points temporels correspondent aux points temporels de l'étude Drug-Induced Renal InjuryConsortium (DIRECT). Abréviations : SCr=créatinine sérique, Hospital=admission à l'hôpital, Predrug=avant l'exposition au médicament, DIRI=définition d'atteinte rénale induite par le médicament rencontrée, DrugDC {{8} } arrêt du médicament ou réduction de dose, Nadir Scr=sérum le plus bas après V-AKI, Hospital Disch= sortie de l'hôpital

Les facteurs de risque de base dans les cas de V-AKI comprenaient la septicémie (30 %), les maladies cardiaques (30 %), le diabète sucré (30 %), l'anémie (20 %), l'exposition au radiocontraste (10 %), les maladies du foie (10 %) et hypoalbuminémie (10 pour cent) (Figure 2).

Au plus, les cas de V-AKI avaient reçu des épisodes de dosage de trois médicaments de vancomycine. Les doses quotidiennes de vancomycine variaient de 1000 à 4 000 mg. Le nombre moyen (intervalle interquartile (IQR)) de jours passés dans chaque épisode de dosage est illustré à la figure 3. 29,6 ± 16,3, 38,0 ± 13 mg/L, respectivement. Cependant, la différence de concentrations entre chacun des épisodes n'était pas statistiquement significative (épisode 1 vs 2 p=0.5, épisode 2 vs 3 p=0.41)

D'autres données sur les résultats sont résumées dans le tableau 2. Compte tenu de la gravité de la blessure, 20 % des patients ont nécessité une thérapie de remplacement rénal. La mortalité hospitalière était de 10 %. À la sortie de l'hôpital, 90 % des patients n'ont pas récupéré de V-AKI. Six patients avaient une SCR mesurée au jour 28 après la blessure et quatre au jour 90. Au jour 28, deux des six patients (33 %) avaient une AKD, mais aucun des quatre patients restants n'avait d'AKD au jour 90.Un reindes biopsies ont été réalisées dans 20 % des cas d'IRA-V (tableau 2).

Les 12 échantillons qui ont été qualifiés pour les analyses après avoir imposé le filtre pour faire correspondre les peptides avec leurs spectres apparentés, contenaient un total de 2009 protéines. Ces protéines ont été analysées plus avant. Tout d'abord, une analyse des coordonnées principales (PCoA) a été effectuée pour comparer le protéome global de chaque échantillon. Cette analyse a révélé une séparation significative (PERMANOVA p-value=0.037) entre l'AKI et les échantillons de contrôle (Figure 4), récapitulant le phénotype au niveau systémique au niveau de la protéine exosome également, augmentant ainsi notre confiance dans ces ensembles de données . La force de l'association entre chaque protéine et le statut V-AKI a été classée à l'aide de la métrique de la valeur pi, qui combine la signification de la valeur p avec le changement de facteur [12].

Figure 4. La composition du protéome distingue les exosomes urinaires des patients V-AKI et des témoins. (A) Analyse des coordonnées principales des protéomes de l'échantillon. La métrique de distance Bray-Curtis a été utilisée pour calculer les différences entre le protéome de l'échantillon et un tracé des coordonnées principales est présenté. Une séparation le long des axes 1 et 3 a été observée entre les échantillons AKI (rouge) et les échantillons de contrôle (bleu). (B) Boxplot résumant la distance de Bray-Curtis entre le contrôle et les échantillons AKI. La séparation statistique entre l'AKI et les échantillons témoins illustrés en (A) a été testée à l'aide d'un test d'analyse permutationnelle de la variance (PERMANOVA). Des boîtes à moustaches sont présentées résumant les résultats lors de la comparaison des distances d'échantillons de contrôle ou d'AKI à des échantillons de contrôle.

Ensuite, des comparaisons binaires entre V-AKI et des échantillons témoins ont donné 42 protéines significativement associées au phénotype AKI et 26 protéines associées au phénotype témoin (score Pi> 1) (tableau supplémentaire S1). Une parcelle de volcan illustrant l'importance et le changement de pli associés à chaque protéine est illustrée à la figure 5A. Les principales protéines discriminantes pour les cas de V-AKI étaient le fibrinogène, le complément C3, le complément C4, la protéine de liaison à la galectine-3-, l'alpha-2 macroglobuline, l'immunoglobuline mu constante lourde et la sérotransferrine (Figure 5B). Une analyse d'enrichissement de l'ensemble de gènes a été réalisée parmi des protéines significatives pour identifier les catégories de protéines altérées chez les patients V-AKI et les résultats sont résumés dans le tableau supplémentaire S1. Il a été démontré que plusieurs protéines associées au phénotype AKI avaient des fonctions liées à l'inflammation et/ou à la médiation du phénotype inflammatoire. Pour tester si ces changements protéiques pourraient être liés à des changements dans la signalisation sous-jacente des cytokines, une inférence de cytokine a été effectuée, ce qui a indiqué une forte relation entre les protéines associées à l'AKI et les cytokines IL10, IL6 et TNF. Ces cytokines contenaient respectivement 2,8, 2,3 et 2,1- fois plus de connexions aux protéines associées à l'AKI qu'aux protéines associées au contrôle, comme le résume la figure 5C. Les réseaux d'interaction protéine-protéine des protéines associées à l'AKI et des cytokines inférées ont montré des connexions principalement pro-inflammatoires parmi les protéines associées à l'AKI, comme résumé dans la figure 5D.

Figure 5. Associations au niveau des protéines à V-AKI. (A) Volcano plot affichant la signification du changement de pli et du test t de chaque protéine par rapport au statut V-AKI. Les 10 principales protéines associées à l'IRA et au statut de contrôle sont indiquées respectivement en bleu et en rouge. Les autres protéines associées basées sur un Pi Score > 1 sont indiquées en jaune. (B) Un score Pi, qui tient compte à la fois du changement de pli et de la signification du test t, a été calculé pour chaque protéine et les protéines avec les associations les plus fortes sont tracées. (C) Topcytokines associées à AKI ou protéines de contrôle. Une approche d'inférence de cytokines basée sur le réseau a été adoptée et les cytokines présentant les scores d'enrichissement les plus forts vers l'AKI ou les protéines associées au contrôle sont présentées. Les barres rouges représentent les cytokines liées aux protéines associées à l'IRA, les barres bleues représentent les cytokines liées aux protéines associées au contrôle. (D) Réseau d'interaction protéine-protéine de protéines associées à l'AKI et de cytokines déduites enrichies en AKI. Le bord externe des nœuds protéiques est coloré en fonction des associations avec des cytokines pro ou anti-inflammatoires. La taille de chaque nœud représente la force de l'association statistique de chaque protéine au statut AKI.

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3. Débat

Nous rapportons une nouvelle approche pour utiliser les exosomes urinaires pour éclairer les mécanismes physiopathologiques impliqués dans lesun reinblessureen utilisant la vancomycine comme toxique rénal prototypique. L'un des points forts de cette étude est l'incorporation de données bien caractérisées au niveau des patients de l'étude DIRECT [10] développée pour élucider les mécanismes, y compris la génomique des effets induits par les médicaments.un reinblessure. Les sujets atteints d'IRA de stade 2 ou plus ont été exposés à des facteurs de risque conventionnels au départ. Tous les sujets de l'étude présentaient des concentrations plasmatiques de vancomycine significativement élevées malgré l'administration de doses quotidiennes inférieures au seuil de néphrotoxicité généralement accepté de 4 g par jour [13]. De nombreux sujets n'ont pas complètement récupéré de V-AKI à la sortie de l'hôpital et ont eu une maladie rénale aiguë pendant le mois suivant la blessure. Comme prévu, peu de patients ont subi une biopsie rénale.

La protéomique des exosomes urinaires/vésicules extracellulaires (VE) a démontré que les protéines discriminatoires ciblées pour les cas de V-AKI comprenaient le complément C3, le complément C4, la protéine de liaison à la galectine-3-, le fibrinogène, l'alpha-2 macroglobuline, l'immunoglobuline mu constante lourde , et la sérotransferrine. Ces découvertes d'exosomes éclairent les mécanismes de blessure au niveau subcellulaire/supra-moléculaire pour V-AKI et servent potentiellement de biomarqueurs le long du continuum du processus pathologique induit par les médicaments.

Les exosomes, présents dans le sang et l'urine, jouent un rôle important dans la communication intercellulaire, la coagulation et la gestion des déchets [14]. Après une crise aiguë liée à une toxineun reinblessure, les exosomes libérés par les cellules épithéliales tubulaires peuvent communiquer des signaux de blessure pour recruter une infiltration de macrophages et favoriser l'inflammation tubulo-interstitielle [15]. Nous avons estimé que la teneur en protéines des exosomes différerait entre les cas de V-AKI et les témoins sains. Deux cent cinquante et une protéines étaient dérégulées dans V-AKI, et celles-ci semblaient être principalement impliquées dans les voies inflammatoires et de coagulation. Parmi ces 251 protéines, notre analyse a démontré que le complément C3, le complément C4, la protéine de liaison à la galectine-3-, le fibrinogène, l'alpha-2 macroglobuline, l'immunoglobuline mu constante lourde et la sérotransferrine étaient significativement associés aux cas de V-AKI.

Sur la base de nos résultats selon lesquels C3 et C4 figuraient parmi les protéines d'exosome V-AKI les plus discriminantes, nous proposons que l'activation d'un système du complément soit impliquée dans la lésion tubulaire rénale induite par la vancomycine. Ceci est également en bon accord avec la littérature publiée selon laquelle l'activation du système du complément joue un rôle dans la glomérulonéphrite à complexes immuns et un large éventail de maladies rénales [16]. Les lésions rénales médiées par l'activation du complément dans l'IRA dues à l'ischémie ou à l'exposition à la néphrotoxine ont été liées à des événements inflammatoires systémiques qui déclenchent et contribuent à des lésions d'organes à distance et à la mortalité des patients [17]. Dans les modèles de lésion d'ischémie-reperfusion (IR), l'hypoxie, l'épuisement de l'ATP et les dommages mitochondriaux entraînent la génération de radicaux libres d'oxygène lors de la reperfusion [18]. Les cytokines, les chimiokines et l'activation du complément amplifient l'inflammation, entraînant une lésion tubulaire aiguë. De plus, les souris déficientes en récepteurs C3a et C5a sont protégées contre les lésions IR [19,20]. Il a été démontré que les lésions IR régulent à la hausse la production locale de composants du complément enun reincellules endothéliales et tubulaires [16,21]. Plusieurs études sur des modèles animaux et des sujets humains ont identifié un dépôt accru de produits protéiques du complément tels que C3 et C4 le long de la membrane basale tubulaire après un traumatisme ou une blessure dans leun rein. Ces niveaux accrus de dépôts ne se sont pas avérés présents de manière significative dans la région péritubulaire ou glomérulaire, mais sont fortement concentrés dans la membrane tubulaire, comme on le voit dans les biopsies de reins de modèles humains et animaux [17]. Les exosomes et les véhicules électriques peuvent transporter des composants du complément circulatoire lorsque l'activation du complément est dérégulée [22,23]. Plusieurs expériences cellulaires et observations cliniques ont confirmé que les VE libérés transportent et modulent les protéines du complément et, simultanément, leur production dans un état inflammatoire est également capable d'influencer le nombre de vésicules circulatoires [23]. Cette interdépendance des deux processus conduit à la conclusion que les véhicules électriques présentent le potentiel d'être des sources de biomarqueurs, des cibles et des agents de délivrance thérapeutique vers des composés complémentaires et immunomodulateurs qui sont très pertinents dans le cadre des mécanismes inflammatoires de l'IRA. Notre constatation que les échantillons V-AKI par rapport aux témoins sains, démontre le rôle des réponses immunitaires à la toxicité directe de la vancomycine dans les cellules tubulaires rénales. En plus de toute la teneur en protéines ci-dessus, les exosomes / EV dérivés de l'urine représentent également des biomarqueurs non invasifs potentiels comme alternatives à la biopsie rénale pour détecter et informer sur le rôle du système du complément dans les maladies induites par les médicaments.un reinblessure.

Bien que de nombreuses études antérieures (voir les quelques phrases suivantes pour des références spécifiques) se soient concentrées sur le rôle de la galectine-3 (Gal-3) dansun reinblessure, il existe peu de données sur la protéine de liaison à la galectine-3 (Gal-3-bp). Gal-3 est exprimé dans les tubules collecteurs du rein et a pour fonction de favoriser la néphrogénèse, de moduler les interactions cellule-cellule et cellule-matrice et de réguler l'inflammation [24–26]. Henderson et al. ont examiné le rôle de Gal-3 dans l'inflammation et ont découvert que Gal-3 est un élément clé dans l'inflammation chronique et si les lésions tissulaires deviennent récurrentes. Il facilite la "cloison" de la lésion tissulaire, retardant la propagation de la lésion [27]. De plus, Nishiyama et al. ont démontré chez des rats atteints d'IRA ischémique que l'ARNm de Gal-3 était régulé positivement, et la reperfusion suivante, l'immunohistochimie a révélé une augmentation de Gal-3 dans les segments de néphron [25]. Tsuchiyama et al. ont constaté que l'administration de Gal-3 chez des rats atteints de néphrite sérique néphrotoxique entraînait une réduction de l'excrétion urinaire de protéines, de la formation de croissants et une diminution de l'infiltration de macrophages dans les glomérules [28]. Cela suggère qu'après une lésion ischémique ou à médiation immunitaire, Gal-3 joue un rôle dans la régénération. En tant que partenaire apparenté à Gal-3, le rôle fondamental de Gal-3-bp et la raison de sa régulation à la hausse dans les lésions néphrotoxiques dues à la vancomycine et à d'autres agents, constitueraient un objectif impératif dans les futures enquêtes.

Notre étude a également révélé que les trois sous-unités du fibrinogène sont dérégulées, en bon accord avec les données publiées précédemment. Le fibrinogène est une molécule plasmatique dimérique soluble et chaque dimère est composé de trois polypeptides : alpha, bêta et gamma [29]. Il joue un rôle clé dans l'hémostase et la coagulation, mais s'est également révélé important dans la régulation des affections à médiation inflammatoire [30–32]. Ajay et al. ont montré que la disponibilité du fibrinogène est importante pour la fonction rénale, l'inflammation et la survie [33]. De plus, le fibrinogène pourrait avoir un effet antiadhésif sur les cellules épithéliales rénales qui pourrait être bénéfique en aidant à prévenir l'obstruction tubulaire [34]. Le fibrinogène est significativement augmenté et régulé positivement dans l'IRA et a déjà été évalué comme un biomarqueur potentiel pour la détection précoce de l'IRA [29]. Hoffman et al., ont étudié le changement du fibrinogène après l'ischémie/reperfusion et l'administration de cisplatine chez le rat, et l'ARNm a été régulé positivement 30 min après une lésion IR bilatérale et a atteint un pic à 48–72 h, alors que dans l'administration de cisplatine, l'expression de l'ARNm du fibrinogène était détecté à 24 h [29]. Le fibrinogène urinaire a été détecté dès 3 h après la lésion de reperfusion ischémique et 24 h après l'administration de cisplatine correspondant à de fortes augmentations deun reinblessuremolécule 1 (KIM-1) [29].

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Historiquement, deux mécanismes physiopathologiques différents pour la V-AKI ont été généralement acceptés, la nécrose tubulaire aiguë due aux effets toxiques directs et la néphrite interstitielle aiguë. L'épithélium tubulaire proximal rénal subit une perte d'intégrité du cytosquelette, une nécrose et une apoptose dans la nécrose tubulaire aiguë [35]. Les cellules nécrotiques libèrent des molécules qui régulent à la hausse le système immunitaire inné, induisant une inflammation et accélérant les lésions tubulaires [35]. Dans la présente étude, nous avons mis en évidence des marqueurs inflammatoires dans les VE urinaires de patients atteints de V-AKI. De plus, nous avons trouvé une relation pro-inflammatoire entre les cytokines IL10, IL6 et TNF et nos principales protéines discriminantes AKI. Prises ensemble, ces données suggèrent que la physiopathologie de V-AKI est celle d'une toxicité tubulaire avec régulation à la hausse de l'inflammation pendant la période de 24 à 72 h après la blessure.

Notre étude comporte plusieurs limites. La petite taille de l'échantillon de 22 patients de sexe masculin et à prédominance caucasienne limite la généralisation de nos résultats à d'autres sexes, races et ethnies. Une deuxième limite à notre étude était que l'échantillon d'exosome urinaire de chaque patient contenait des quantités variables de protéines totales, ce qui rendait difficile la mesure de protéines spécifiques, en particulier pour celles dont les quantités absolues étaient inférieures. Bien que ce ne soit pas nécessairement la limite de cette étude en soi, car la capacité de chaque individu à emballer des protéines sur ses exosomes urinaires est naturellement variable, les quantités plus faibles de protéines chez certains individus limitent notre capacité à effectuer des analyses plus poussées et à tirer des conclusions significatives qui sont généralisables à populations plus importantes. Une troisième limitation est l'échantillon à point unique dans le temps qui limite notre compréhension des changements cellulaires se produisant à différentes phases du continuum AKI, par exemple, la phase de blessure immédiate, la phase de réparation, etc. changements, le stress oxydatif induit par l'accumulation de médicaments et la régulation à la hausse des voies immunitaires en réparation. L'étude actuelle a inclus des patients tels que définis par les seuils de Scr. La créatinine sérique est un biomarqueur fonctionnel rénal imparfait puisque les élévations de la SCR sont souvent en retard sur la lésion [36]. Cela limite la sensibilité et la spécificité de Scr pour détecter précocementun reinblessure[36], et des études ont vu le jour identifiantun reinblessurebiomarqueurs tels queun rein blessurela molécule 1 (KIM1) et la lipocaline associée à la gélatinase des neutrophiles (NGAL) pour la détection précoce de la néphrotoxicité [37,38]. Comme indiqué précédemment, les biomarqueurs ont le potentiel de détecter à la fois des niveaux manifestes et subcliniques deun reinblessure[39,40].

4. Matériels et méthodes

4.1. Sélection des patients

Des échantillons d'urine de 10 patients avec V-AKI, qui ont été inscrits dans l'étude DIRECT [10] et 12 échantillons d'urine de contrôle sains du UAB-UCSD O'Brien Center Biorepository ont été inclus dans l'analyse. Les sujets témoins ont été appariés par sexe, race et décennie d'âge aux sujets de l'étude et n'ont eu aucune exposition à la vancomycine ou connueun reinblessure. L'étude DIRECT est une étude internationale examinant les prédicteurs pharmacogénétiques deun reinblessureen utilisant une étude d'association à l'échelle du génome des cas et des témoins basés sur la population [10]. L'étude DIRECT a été approuvée par le comité de recherche institutionnel (IRB #121651) et un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants avant l'inscription, ce qui comprenait la fourniture de l'utilisation d'échantillons stockés pour de futures analyses. L'IRA a été définie dans DIRECT comme une réduction brutale de la fonction rénale démontrée par l'un des critères suivants : (1) augmentation absolue de la créatinine sérique (Scr) (supérieure ou égale à 0,3 mg/dL ou supérieure ou égale à 26,4 μmol/ L) (dans un délai de 48-h) à partir de la valeur Scr de référence, (2) pourcentage d'augmentation de Scr supérieur ou égal à 50 % (1,5 fois par rapport à la référence) en sept jours, (3) réduction de l'urine sortie (oligurie documentée de<0.5 ml/kg/h="" for="">6 h) malgré une réanimation liquidienne adéquate, le cas échéant, (4) diminution absolue du Scr supérieure ou égale à 0.3 mg/dL ou supérieure ou égale à 26,4 µmol/L (dans 48- h) par rapport à la Scr de référence, et (5) diminution relative de la Scr supérieure ou égale à 50 % (1,5 fois par rapport à la référence) en sept jours. Des patients atteints d'IRA de stade 2 ou plus après une exposition à la vancomycine ont été inclus dans l'étude. Les données cliniques, y compris les données démographiques, les antécédents médicaux, les résultats des examens physiques, les signes vitaux, la chimie du sang et de l'urine, les résultats de la biopsie et les données sur le dosage des médicaments, ont été recueillies aux moments suivants : (1) admission à l'hôpital, (2) initiation de la vancomycine, ( 3) pic de blessure, (4) arrêt du médicament ou réduction de la dose, (5) résolution de la blessure, (6) sortie de l'hôpital, (7) 28 jours et (8) 90 jours après la blessure. Un épisode de dosage de vancomycine a été défini comme un changement de dose ou de fréquence. La maladie rénale aiguë (MRA) est définie comme la persistance d'une IRA de stade 1 ou plus supérieure ou égale à 7 jours après l'exposition [41]. Les patients ont été classés avec AKD à la sortie de l'hôpital si l'IRA de stade 1 ou plus persistait et si le temps écoulé entre l'exposition et la sortie de l'hôpital était supérieur à sept jours. Des échantillons d'urine et de sang total ont été obtenus de tous les participants. Tous les cas de V-AKI ont été jugés par deux néphrologues indépendants (EM, JC, RL) pour déterminer la causalité. Une description complète des méthodes a été publiée précédemment [10].

4.2. Préparation des exosomes et collecte de données protéomiques

Des échantillons d'urine et de sang ont été prélevés sur les participants à l'étude DIRECT et les échantillons ont été congelés à -80 ◦C avant la préparation des exosomes. Les échantillons d'urine utilisés dans cette analyse ont été sélectionnés dans la période la plus proche de l'insulte rénale allant de 24 à 72 h aprèsun reinblessure. Les exosomes ont été extraits d'échantillons d'urine AKI congelés à l'aide d'un protocole interne développé sur la base du principe d'exclusion de solvant utilisant une précipitation induite par le polyéthylène glycol (PEG), comme décrit dans Rao et al. Une publication récente [42] page des protéines exosomales a été effectuée avant la trypsinisation sur gel en utilisant des gels NuPAGE bisTris10 pour cent d'acrylamide à 12 puits pour résoudre 40 µL de protéines à partir d'exosomes des échantillons d'urine de contrôle et d'AKI.

Les extraits de gel ont été combinés avec un tampon pour empêcher la protéolyse qui contenait 75 mM de NaCl (Sigma, St. Louis, MO, USA), 3 % de dodécylsulfate de sodium (SDS, Fischer, Arnold AFB, Tullahoma, TN, USA), 1 mM de NaF (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 mM de bêta-glycérophosphate (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 mM de bêta-glycérophosphate (Sigma, Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 mM de sodium orthovanadate (Sigma, St. Louis, MO, USA), 10 pyrophosphate de sodium mM (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF, Sigma) et 1 × Complete Mini EDTA comprimé d'inhibiteur de protéase libre tout en HEPES 50 mM (Sigma, St. Louis, MO, USA), pH 8,5. Pour dénaturer les protéines, un volume égal d'urée 8 M dans HEPES 50 mM, pH 8,5 a été ajouté et la sonication de la sonde a été effectuée en utilisant deux intervalles 10- à une amplitude de 25 %. Les protéines ont été réduites, alkylées et désactivées à l'aide de dithiothréitol et d'iodoacétamide, comme décrit précédemment [43]. Les protéines ont été précipitées en ajoutant de l'acide trichloroacétique (Sigma, St. Louis, MO, USA) à des échantillons sur de la glace et en culottant les protéines par centrifugation à 4 ◦C. Les culots de protéines ont été lavés deux fois avec de l'acétone glacée. Les culots de protéines ont été séchés à 56 °C pendant 30 min, puis remis en suspension dans de l'urée 1 M dans de l'HEPES 50 mM, puis digérés pendant une nuit à température ambiante avec 6 µg de LysC (Wako, Richmond, Commonwealth de Virginie, États-Unis) suivi de {{27} }h digestion avec de la trypsine de qualité séquençable (Promega, Fitchburg, WI, USA) à 37 ◦C. Les échantillons ont été dessalés par C18 Sep-Paks et les protéines ont été quantifiées [44]. Un total de 1,0 ug de protéines par échantillon a été analysé par chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS [2]) en utilisant un gradient de chromatographie liquide de 85 min sur un Easy-nLC 1000 (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA) connecté en ligne à un spectromètre de masse Orbitrap Fusion (Thermo Fischer Scientific).

La chromatographie a été réalisée sur une colonne de 30 cm tirée à la maison et remplie d'un triple remplissage avec 0.5 cm, 0.5 cm et 30 cm de 5 µm C4, 3 µm C18 et 1,8 µm C18, respectivement, et chauffés à 60 ◦C. Les peptides ont d'abord été chargés à 500 bars, suivis d'un gradient de chromatographie allant de 6 à 25 % d'acétonitrile sur 70 min, suivi d'un gradient de 5-min à 100 % d'acétonitrile, qui a été maintenu pendant 10 min. L'ionisation par électrospray a été réalisée en appliquant 2000 V à travers une jonction en T en acier inoxydable reliant la colonne analytique et le système Easy-nLC. Chaque échantillon a été suivi de deux lavages commençant par un gradient de 3 à 100 % d'acétonitrile sur 15 min avec 10 min supplémentaires à 100 % d'acétonitrile. Une plage de masse à charge (m/z) de 375 à 1500 a été scannée pour les peptides avec des états de charge entre 2 et 6. Les données centroïdes ont été utilisées pour la quantification des pics. L'acquisition a été exécutée dans un mode d'ions positifs dépendant des données. Les spectres bruts ont été recherchés dans Proteome Discoverer Version 2.1 par rapport à la base de données de référence UniProt (www.uniprot.org (accessible le 5 novembre 2017)) pour Homo sapiens en utilisant l'algorithme Sequest [18] parallèlement à une approche de base de données inversée utilisée pour contrôler les peptides et les fausses découvertes. (FDR) à 1 % [17]. Digestion de trypsine in silico comme spécifié dans les paramètres de recherche avec une longueur minimale de peptide de six acides aminés. Les paramètres de recherche comprenaient également une modification dynamique pour l'oxydation des méthionines et une modification statique de la carbamidométhylation des cystéines. La tolérance de masse des précurseurs a été fixée à 50 ppm et la tolérance de masse des fragments à 0,6 Da.

En plus des correspondances spectrales et des protéines limitées à<1% fdr,="" peptide="" matches="" were="" further="" screened="" to="" only="" include="" peptide="" spectral="" matches="" (psms)="" identified="" with="" high="" confidence.="" the="" summed="" abundance="" of="" the="" area="" under="" the="" curve="" of="" ms1="" peaks="" associated="" with="" psms="" was="" used="" to="" represent="" protein="" abundances.="" to="" help="" account="" for="" run-to-run="" variation="" in="" lc-ms2="" experiments,="" the="" raw="" protein="" abundances="" were="" next="" normalized="" by="" a="" two-step="" process.="" in="" the="" first="" step,="" protein="" abundances="" were="" divided="" by="" the="" average="" abundance="" of="" a="" given="" protein="" throughout="" the="" experiment="" divided="" by="" the="" median="" of="" the="" protein="" averages="" observed="" throughout="" the="" experiment.="" in="" the="" second="" step,="" the="" adjusted="" protein="" abundances="" were="" divided="" by="" the="" median="" protein="" abundances="" observed="" within="" their="" respective="" samples="" divided="" by="" the="" median="" protein="" abundance="" observed="" in="" the="" entire="" experiment.="" records="" of="" the="" normalization="" and="" analysis="" of="" proteomics="" data="" are="" available="" in="" a="" jupyter="" notebook="" form="" at="">

4.3. Analyse des données protéomiques

Les enregistrements de l'analyse des données protéomiques ont été téléchargés dans un format de bloc-notes jupyter dans un référentiel Github (accessible le 3 mars 2021)). L'analyse des coordonnées principales (PCoA) a été réalisée à l'aide de Qiime2 (version 2019-7) [45]. La commande Time Diversity Core-Metrics a été utilisée pour calculer les distances entre les échantillons à l'aide de la métrique Bray-Curtis et la visualisation à l'aide d'un PCoA. L'analyse statistique des distances entre les échantillons de contrôle et de V-AKI a été réalisée à l'aide d'un test PERMANOVA par paires via la commande "qiime diversité bêta-groupe significatif". Une visualisation en boîte à moustaches de ces résultats a été créée via le package seaborn (accessible le 3 mars 2021)). Des comparaisons binaires des cas de V-AKI et des sujets témoins ont été effectuées à l'aide du package scipy ((accessible le 3 mars 2021)) à l'aide d'un test t indépendant avec une variance inégale. La force de l'association entre chaque protéine et le statut V-AKI a été classée à l'aide de la métrique de la valeur pi qui combine la signification de la valeur p avec le changement de facteur [12]. Comme décrit précédemment [46], les associations significatives les mieux classées ont été définies comme ayant une valeur pi > |1|. Chaque association de protéines au statut V-AKI a été tracée dans un diagramme de volcan pour mettre davantage en évidence l'emplacement des protéines les mieux classées -10. L'analyse de l'enrichissement de l'ensemble de gènes a été réalisée à l'aide du serveur DAVID [47], en comparant les protéines significatives (valeur pi>|1 |) à un arrière-plan de toutes les protéines identifiées dans l'ensemble de données. Des groupes d'enrichissements fonctionnels connexes sont indiqués dans le tableau supplémentaire S1.

To test for a relationship between V-AKI-associated proteins and inflflammatory cytokines, a recently developed network-based cytokine inference approach was utilized [48]. Briefly, a list of cytokines (TGFb, TNF, IFN, IL1-40, CXCL1-16, CCL1-27) was submitted alongside signifificantly altered proteins (pi-value > |1|) to the STRING-db tool [49]. Connections between proteins were determined using all interaction sources and a minimum interaction score >0.4. Les cytokines ont d'abord été filtrées pour avoir au moins cinq connexions avec des protéines significativement modifiées. Ensuite, la proportion de connexions entre chaque cytokine et les protéines associées à V-AKI ou associées au contrôle a été comparée au nombre total de connexions entre V-AKI ou les protéines associées au contrôle. Pour tenir compte des différences dans le nombre de connexions que chaque cytokine a avec d'autres protéines, cette valeur a ensuite été comparée au nombre de connexions que chaque cytokine avait avec toutes les protéines significativement modifiées. Les scores d'enrichissement pour les cytokines sélectionnées ont été tracés pour leurs associations avec les protéines V-AKI ou associées au contrôle. Enfin, une recherche affinée des protéines associées à V-AKI et des cytokines avec des connexions enrichies aux protéines associées à V-AKI a été visualisée pour leurs interactions à l'aide de Cytoscape version 3.5.1 [50]. Les réseaux d'interaction protéine-protéine ont été décorés en dimensionnant chaque protéine associée à V-AKI en fonction de leur association de pi-score au statut V-AKI et colorés en ayant une connexion déduite aux cytokines enrichies avec des effets pro ou anti-inflammatoires.

cistanche aux herbes du dragonpeut traiterlésion rénale

5. Conclusions

Nous avons cherché à mieux comprendre le mécanisme de lésion de la V-AKI à partir de cas cliniquement jugés et, fait intéressant, nous avons découvert que le complément, la protéine de liaison à la galectine-3 et le fibrinogène étaient associés de manière significative à la V-AKI. Les résultats des études précédentes et les nôtres suggèrent un rôle du système du complément et des voies inflammatoires dans la V-AKI. Alors que des études plus importantes sont nécessaires pour valider les processus moléculaires dans les dommages induits par la vancomycine et les voies de réparation qui en découlent, les résultats indiquent que les exosomes urinaires peuvent apporter des informations importantes sur les mécanismes physiopathologiques et peuvent servir de biomarqueurs pour les dommages induits par les médicaments.un reinblessure.

Les contributions de l'auteur:

Conceptualisation, LA et SPR, méthodologie, SV, SPR, DJG, RM ; logiciel, DJG, RHM, analyse formelle, LA, AL, RHM ; enquête, AL, JA, VJ, SB, MC-T., PN ; rédaction—préparation du brouillon original, AL, JA, VJ, LA ; rédaction—révision et édition, RHM, DJG, MC-T., AT, AA, JC, MSJ, EM, RM, PN ; supervision, SV, SPR; administration de projet, Los Angeles ; financement acquisition, LA Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.

Financement:

Cette recherche a été financée par l'International Serious Adverse Events Consortium. MCT a été soutenu par la subvention de formation T32 DK007202.

Déclaration du comité d'examen institutionnel : l'étude a été menée conformément aux directives de la déclaration d'Helsinki et approuvée par le comité d'examen institutionnel (ou comité d'éthique) de l'université de Californie, programme de protection de la recherche sur les sujets humains de San Diego (IRB#121651).

Déclaration de consentement éclairé : un consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets impliqués dans l'étude

Remerciements :

Nous tenons à remercier les contributions des enquêteurs DIRECT : Dinna Cruz, Stuart Goldstein, Patrick Murray, Andrew Davenport, Andrew Lewington, DavidSelewski, Michael Zappitelli, Marlies Ostermann, Li Yang, Bhavna Pandya, Patrick Brophy, DanielaPonce, Julia Steinke, Josee Bouchard, Carlos Irarrazabal, David Askenazi, Nitin Kolhe, RolandoClaure-Del Granado, Nadine Benador, Clare Castledine, Jonathan Barratt, Sunil Bhandari, AlyssaRiley, Ayse Akcan-Arikan, TK Davis, Christopher Farmer, Mark Thomas, Fred Pang, Kar Hui Ng , Hansjoerg Rothe.

Les conflits d'intérêts:

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.

Extrait de : "Les exosomes urinaires identifient les voies inflammatoires dans l'insuffisance rénale aiguë associée à la vancomycine" par Linda Awdishu

---Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 2784