Une formulation micellaire de quercétine prévient la néphrotoxicité du cisplatine

pour plus d'informations :ali.ma@wecistanche.com

Alfredo G. Casanova, Marta Prieto, Clara I.Colino, & et al.

Le flavonoïde antioxydantquercétinea été montré pour empêchernéphrotoxicitédans des modèles animaux et dans une étude clinique et est donc un candidat prophylactique très prometteur en cours de développement.Quercétinela solubilité est très faible, ce qui handicape l'application clinique. Le but de ce travail était d'étudier, chez le rat, la biodisponibilité et l'efficacité néphroprotectrice d'une formulation micellaire de Pluronic F127-encapsuléquercétine(P-quercétine), avec une hydrosolubilité améliorée. Administration intrapéritonéale de P-quercétineentraîne une augmentation de la concentration plasmatique et de la biodisponibilité dequercétinepar rapport à l'administration équimolaire dequercétine. De plus, P-quercétineconserve les propriétés néphroprotectrices globales, et améliore même légèrement certains paramètres de la fonction rénale, par rapport à laquercétine. Plus précisément, P-quercétineréduit l'augmentation de la créatinine plasmatique (de 3,4±0.5 à 1,2±0.3 mg/dL) et de l'urée (de 490.9±43,8 à 184,1± 50.1 mg/dL) et la diminution de la clairance de la créatinine (de {{20}}.08±0.02 à 0.58±0.19 mL/min) induite par le médicament chimiothérapeutique néphrotoxique cisplatine, et il a amélioré la preuve histologique des dommages tubulaires. Cette nouvelle formulation aux propriétés cinétiques et biopharmaceutiques améliorées permettra d'explorer davantagequercétinecomme candidat néphroprotecteur à des doses plus faibles et par des voies d'administration orientées vers son utilisation clinique.

Mots clés:cisplatine;néphrotoxicité; flavonoïde;quercétine; néphroprotection; biodisponibilité ;un rein;micelles; solubilité; formulation

La prévention denéphrotoxicité

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1. Introduction

Médicamentnéphrotoxicitéest une grave préoccupation médicale et économique [1,2], 25 % des 100 médicaments les plus utilisés dans les unités de soins intensifs étant néphrotoxiques [3], etnéphrotoxicitéest également une cause importante d'abandon de candidats au cours du processus de découverte de médicaments 4]. Le cisplatine est un agent antitumoral à base de platine fréquemment utilisé dans le traitement d'une diversité de tumeurs malignes solides [5,6]. Près de 30 pour cent des patients présentent des signes denéphrotoxicitépendant les dix premiers jours suivant l'administration de cisplatine, ce qui pose une limite importante à sa posologie et à son efficacité thérapeutique [5-8]. Cisplatine aiguënéphrotoxicitéprovoque une tubulopathie dérivée d'une accumulation de 5- fois dans les cellules épithéliales du tubule proximal, par rapport à sa concentration plasmatique [9-1l], et dans une moindre mesure dans le tubule distal [12,13 ].

La tubulopathie au cisplatine se caractérise par des troubles électrolytiques (principalement une hypomagnésémie et une hypokaliémie) etaiguun reinblessure(IRA). L'IRA est un syndrome courant caractérisé par une baisse brutale du débit de filtration glomérulaire (DFG), une azotémie sévère et, souvent, une oligurie ou une anurie [7,14]. De plus, le dysfonctionnement endothélial qui augmente la résistance vasculaire rénale et altère l'autorégulation contribue également à l'IRA induite par le cisplatine [9]. Habituellement, l'IRA est une affection réversible, qui a néanmoins un impact significatif sur les résultats des patients, notamment une mortalité hospitalière élevée (plus de 50 % des cas chez les personnes gravement malades), une hospitalisation prolongée, des coûts de soins de santé supplémentaires et, au milieu et scénarios à long terme, risque accru de développermaladie rénale chroniqueet de la morbimortalité générale et cardiovasculaire [7,14]. Aux niveaux subcellulaire et moléculaire, la cytotoxicité tubulaire du cisplatine est entraînée par une lésion mitochondriale, qui réduit la respiration, produit un stress oxydatif et induit la mort cellulaire apoptotique et nécrotique et une réponse inflammatoire délétère [13, 15, 16]. Le stress oxydatif est reconnu comme un mécanisme central de la cytotoxicité du cisplatine etnéphrotoxicité[12,13,15-17], résultant d'une production accrue d'espèces réactives de l'oxygène et d'une barrière enzymatique antioxydante endogène affaiblie [5,7,18].

Mesures prophylactiques efficaces pour le cisplatinenéphrotoxicitéposent un besoin clinique non satisfait pour améliorer son profil pharmaco-toxicologique et maximiser son utilité. Les stratégies préventives existantes, y compris l'hydratation intensive, n'ont démontré qu'une protection limitée [6,19]. De nouvelles stratégies basées sur la co-administration de néphroprotecteurs sont en cours de développement. Les candidats néphroprotecteurs comprennent des formulations de magnésium |6,9 et, surtout, une variété d'antioxydants [6,20,21]. Les flavonoïdes sont une famille de produits polyphénoliques néphroprotecteurs dérivés de légumes, de fruits, de noix et de vin, avec de fortes propriétés antioxydantes [22].Quercétineest un flavonoïde vedette qui exerce de nombreux effets bénéfiques [23,24], y compris le piégeage des espèces réactives de l'oxygène, la suppression de l'activation plaquettaire, la protection endothéliale, la modulation de l'inflammation, l'inhibition de l'apoptose, la suppression des tumeurs et la néphroprotection. Co-administration dequercétineassocié à une thérapie au cisplatine dans un modèle de tumeur animale offre une néphroprotection sans interférer avec l'effet antitumoral |25,26]. En fait, une méta-analyse mise à jour a identifiéquercétinecomme un candidat très prometteur en tant que neuroprotecteur pour un développement clinique ultérieur [21]. De manière constante, une étude clinique récente a rapporté un effet protecteur dequercétinesur la néphropathie induite par le produit de contraste (CIN) [27].

Une forte limitation à l'application potentielle dequercétine(partagée par les flavonoïdes en général) est sa faible hydrosolubilité résultant de sa structure chimique et de ses fractions, qui réduisent son absorption dans l'intestin grêle, et donc sa biodisponibilité et son efficacité [23, 24, 28]. Fait intéressant, le glucose lipophobequercétineles conjugués (glucosides) sont nettement plus biodisponibles que les aglycones lipophiles, car ces derniers sont moins solubles dans la lumière intestinale [24]. En réalité,quercétineles glucosides des oignons présentent le taux d'absorption le plus élevé et les graisses alimentaires améliorentquercétineabsorption des aglycones dans l'intestin grêle [29]. La très faible hydrosolubilité dequercétineentrave non seulement son utilisation clinique par des voies d'administration pratiques (c'est-à-dire orale, intravasculaire), mais limite également la recherche préclinique. Néanmoins, dans les modèles animaux, des voies alternatives (c'est-à-dire intrapéritonéales) avec des suspensions médicamenteuses peuvent être utilisées à des fins de preuve de concept [25,26].

Quercétinedes formulations avec de nouveaux matériaux porteurs présentant une hydrosolubilité améliorée ont été développées, dont les propriétés biomédicales doivent être testées. Les poloxamères Pluronic sont une classe de matériaux porteurs qui hébergent et améliorent l'absorption de composés insolubles dans l'eau en raison de leur capacité à former des micelles dans des environnements aqueux [30]. Ici, nous avons émis l'hypothèse qu'une formulation micellaire dequercétineencapsulé avec du Pluronic F127 précédemment décrit [31, conserverait les propriétés néphroprotectrices duquercétinetout en offrant des caractéristiques biopharmaceutiques améliorées pour la manipulation, la formulation et l'administration.

Empêchernéphrotoxicité :quercétine

2. Résultats

Une étude de biodisponibilité et de néphroprotection a été réalisée avec la nouvelle formulation mi-cellaire dequercétineencapsulé avec Pluronic F127 [31, et notre formulation traditionnelle de naturelquercétine|25,26|(voir ci-dessous Matériels et Méthodes). Alors que ce dernier était une suspension contenant un tensioactif, le premier était une solution saline sans additif supplémentaire. Notre formulation traditionnelle de produits naturelsquercétinen'était apte qu'à des fins expérimentales, précipité lorsqu'il était laissé immobile et était plus difficile à manipuler et à injecter. En revanche, la formulation micellaire s'est comportée comme une solution et n'a présenté aucun inconvénient d'utilisation.

2.1.Étude de biodisponibilité

En tant que méthode de biodisponibilité comparative, l'évolution dequercétine(Q) la concentration plasmatique a été étudiée après un seul bolus intrapéritonéal de naturel et de P-quercétine(PQ). La figure 1 montre la moyennequercétinecourbes de taux plasmatiques obtenues après administration d'une dose dequercétineou P-quercétine. Les concentrations maximales de médicament (Cmax) observées dans les groupes Q et PQ étaient de 1,14 ± 1,28 ug/mL et de 8,90 ± 4,62 ug/mL, respectivement, soit un incrément de 7,8- fois pour P-quercétine, indiquant que la formulation micellaire augmentait l'absorption du médicament.

Figure 1. Evolution de la concentration plasmatique de quercétine après administration intrapéritonéale d'un bolus unique de P-quercétine équimolaire et de quercétine naturelle.

Les valeurs sont exprimées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM) (n=5 par groupe). *p<0.05;><0.01;><0.001 vs.qgroup.="">quercétine(50mg/kg, ip.);PQ : 100mg/kgi.pP-quercétine(contenant 50 mg/kgquercétine).

Tableau 1. Paramètres pharmacocinétiques après administration intrapéritonéale de P-quercétine et de quercétine naturelle (n=5 par groupe).

Q:quercétine(50 mg/kg, IP ; PQ : P-quercétine(100 mg/kg,ip).AUCo24 :aire sous la courbe partielle ; AUCo : aire sous la courbe totale ; MRT : temps de séjour moyen ; t1/2 : demi-vie d'élimination ; X : pente de la phase terminale.

Le tableau 1 montre les paramètres pharmacocinétiques indépendants du modèle dequercétinechez le rat suite à l'administration d'un bolus unique dequercétineou P-quercétine. Le temps jusqu'à Cmax a été augmenté de 15 min (pourquercétine) à 1 h (pour la quercétine P). Ce retard peut être attribué à la libération prolongée dequercétinede la formulation micellaire. L'exposition globale des rats au flavonoïde était significativement plus élevée pour le P-quercétine, comme en témoigne la plus grande surface sous la courbe (ASC) se traduisant par une biodisponibilité supérieure de 302,5 %. Ces résultats suggèrent que la solubilité plus élevée de la formulation micellaire améliore son absorption.

2.2. Étude d'efficacité néphroprotectrice 2.2.1.État physiologique

Comme en témoigne l'évolution du poids corporel (Figure 2a), l'état de santé général s'est détérioré après traitement au cisplatine, par rapport aux animaux témoins. Ni naturelquercétineni P-quercétinemodifie significativement l'effet du cisplatine. Cependant, les deuxquercétineles traitements ont presque complètement empêché l'augmentation de laun rein/rapport de poids corporel induit par le cisplatine (Figure 2b), un paramètre connu pour être en corrélation avec l'ampleur de l'attrition ànéphrotoxicité[32].

Figure 2. Évolution de l'état de santé général. (a) Pourcentage de variation du poids corporel tout au long de l'expérience ; (b) Rapport poids rein/poids corporel au jour 9.

Les valeurs sont exprimées sous forme de moyenne ± SEM (n=3-5 par groupe). *p<><0.01;><0.001vs.controlgroup.><0.05;><0.01 vs.="" cp="" group.cp:cisplatin(6.5="" mg/kg,="" i.p.)on="" day="">

PC plus Q :quercétine(50 mg/kg, ip) pendant 9 jours et cisplatine (6,5 mg/kg, ip) le jour 3 ; CP plus PQ:P-quercétine(100 mg/kg, ip) pendant 9 jours et cisplatine (6,5 mg/kg, ip) le jour 3.

2.2.2.Évaluation de la fonction rénale et du tissu rénal

Selon les critères internationaux, l'IRA est définie et diagnostiquée en fonction des élévations de la concentration plasmatique de créatinine (Crp)[33-35], un marqueur de substitution du débit de filtration glomérulaire (DFG). D'autres paramètres, tels que la concentration d'urée plasmatique, sont également souvent évalués comme indicateurs d'azotémie [36-38]. Les augmentations de Crp et d'urée plasmatique sont des signes de réduction du DFG et de l'IRA. Dans notre étude, la fonction rénale était sévèrement handicapée par le cisplatine, et cet effet était partiellement amélioré parquercétine. P-quercétinea montré une activité légèrement plus audacieuse que celle naturellequercétine, comme indiqué par des dommages plus légers et un profil de récupération amélioré (Figure 3). Les rats du groupe cisplatine (CP) ont subi une AKI manifeste, car ils ont connu une augmentation progressive et significative de leurs taux plasmatiques de créatinine et d'urée par rapport à ceux des témoins (Figure 3a, b). Ces paramètres ont également augmenté dans les groupes CP plus Q et CP plus PQ, mais dans une mesure significativement plus faible. Les différences entre les groupes CP plus Q et CP plus PQ n'étaient pas statistiquement significatives, cependant, les rats traités avec P-quercétineont montré des niveaux de créatinine et d'urée légèrement inférieurs à ceux traités avec desquercétine. La clairance de la créatinine (ClCr) est une méthode standard de mesure du DFG ]39,40]. En accord avec les données de Cr, le cisplatine a induit une chute profonde, qui a été partiellement atténuée parquercétine(Figure 3c). Dans ce cas, cependant, une différence notable a été observée entre la P-quercétine et la quercétine naturelle, la première étant nettement plus efficace pour améliorer et accélérer la récupération. Il convient de noter que Clcr et Crpl se comportent de manière inversement proportionnelle, ce qui n'est évident qu'en régime permanent. Au cours de l'IRA, cependant, la fonction rénale change continuellement et rapidement, ce qui entraîne un léger découplage de cette relation.

Figure 3. Évolution des paramètres rénaux.

(a) Concentration plasmatique de créatinine ; (b) Concentration plasmatique d'urée ; (c) Clairance de la créatinine ; (d) Protéinurie ; et (e)KIM-1 excrétion urinaire.

Les valeurs sont exprimées sous forme de moyenne ± SEM (n=3-5 par groupe). *p<><><0.001 vs=""><0.05;><0.01vs.cp group.cp:cisplatin(6.5="" mg/kg,i.p.)on="" day="">

PC plus Q :quercétine(50 mg/kg, ip) pendant 9 jours et cisplatine (6,5 mg/kg, ip) le jour 3 ; CP plus PQ : P-quercétine(100 mg/kg, ip.) pendant 9 jours et cisplatine (6,5 mg/kg, ip) le jour 3.KIM-1 :un reinblessuremolécule1.

La protéinurie est également fréquemment mesurée dans le cadre d'une pathologie rénale. Selon le type de dommage sous-jacent, la protéinurie peut avoir une origine glomérulaire (c'est-à-dire une perméabilité accrue de la barrière de filtration glomérulaire) ou, comme dans le cas du cisplatinenéphrotoxicité[13], il peut résulter d'un défaut de réabsorption tubulaire lié à une lésion tubulaire. Une augmentation non significative de la protéinurie a été détectée dans les groupes CP et CP-Q (bien que moins marquée dans ce dernier) au jour 7, qui est revenue à la normale au jour 9. De même, l'excrétion urinaire d'un biomarqueur de lésion tubulaire (c'est-à-dire,un reinblessuremolécule 1; KIM-1)[41,42]a été nettement augmenté par le cisplatine, et cette augmentation a été atténuée par les deux formes dequercétine, bien que P-quercétineétait à nouveau un peu plus efficace.

L'étude histologique du tissu rénal était congruente avec les découvertes biochimiques. Des échantillons de rats traités avec du cisplatine ont révélé une nécrose tubulaire massive dans la bande supérieure de la moelle externe, accompagnée d'une certaine affection corticale, etquercétinelésion corticale réduite (Figures 4 et 5). Les rats qui n'ont reçu que l'agent néphrotoxique ont développé une dilatation et une obstruction tubulaires (considérées comme une accumulation de matière hyaline) et une nécrose tubulaire avec désépithélisation et desquamation cellulaire. Tous les deuxquercétineles traitements ont également réduit les dommages corticaux induits par le cisplatine mais n'ont eu aucun effet sur les dommages médullaires (Figures 4 et 5).

Figure 4. Images représentatives d'échantillons rénaux colorés avec de l'hématoxyline et de l'éosine.

Flèches noires : nécrose tubulaire et desquamation cellulaire ; flèches bleues : dilatations tubulaires ; flèches vertes : dépôts intratubulaires de matière hyaline. CP : cisplatine (6,5 mg/kg, ip) au jour 3 ;

PC plus Q :quercétine(50 mg/kg, ip) pendant 9 jours et cisplatine (6,5 mg/kg, ip) le jour 3 ; CP plus PQ : P-quercétine(100 mg/kg, ip) pendant 9 jours et cisplatine (6,5 mg/kg, ip) le jour 3.

Figure 5. Quantification des dommages rénaux.

Les valeurs sont exprimées en moyenne ± SEM (n =5 images × 3 rats par groupe). *p<><0.001 vs.=""><0.05 vs.cp="">

CP : cisplatine (6,5 mg/kg, ip.) au jour 3 ; CP plus Q :quercétine(50 mg/kg, ip pendant 9 jours et cisplatine (6,5 mg/kg, ip) le jour 3 ; CP plus PQ : P-quercétine(100 mg/kg, ip) pendant 9 jours et cisplatine (6,5 mg/kg, ip) au jour 3. AU : unités arbitraires.

3. Débat

Nos résultats montrent qu'une formulation micellaire dequercétineavec Pluronic F127 (P-quercétine), aux propriétés biopharmaceutiques améliorées, a augmenté la biodisponibilité de ce flavonoïde antioxydant et a conservé (voire légèrement amélioré) ses propriétés néphroprotectrices globales par rapport à laquercétine.

Quercétinea été postulé comme un candidat prometteur pour protéger contre les dommages rénaux causés par un certain nombre de médicaments et de toxines, notamment le cisplatine [25,26], le méthotrexate [43,44], la ciprofloxacine [45], le NaF [46], le HgCl [47l et le cadmium [48]. Bien que ces études aient démontré une efficacité préclinique,quercétinen'a pas été testé dans des scénarios cliniques similaires en raison d'obstacles à la formulation et d'une faible biodisponibilité, à l'exception d'une étude clinique dans laquellequercétineoffraient une certaine protection contre les CIN [27]. Ces deux limitations sont les conséquences de la très mauvaise solubilité dans l'eau (seulement 0.01 mg/mL, à 25 degrés [49]) dequercétine, et de sa faible stabilité (qui est affectée par la température, le pH, l'hydroxylation, l'activité enzymatique et les ions métalliques) [28,29,50]. Administré par voie oralequercétinefait face à une dégradation importante pendant le transit gastrique en raison du pH gastrique très bas (c'est-à-dire 1,5) [50]. Dans l'intestin grêle, chimiquement protégé par un pH plus élevé (7,5), le restequercétinen'est que très peu absorbé. Par conséquent, afin d'augmenter sa biodisponibilité et son efficacité biologique, de nouvelles formulations de quercétine ont été développées dans le but d'améliorer son hydrosolubilité ainsi que de protéger ses fractions actives de la dégradation, notamment les liposomes, les nanoparticules, les nanoémulsions et les micelles [28].

Notre formulation micellaire avec Pluronic F127 augmentequercétinesolubilité décuplé et, dans des études in vitro, a montré un meilleur comportement de dissolution dans les fluides gastriques et intestinaux simulés, car il permet une réduction significative de la taille des particules et une dispersion plus homogène dequercétinedans la matrice polymèreI3l. Cette formulation fournit une quantité considérablement accrue dequercétinedans la circulation sanguine, ce qui entraîne une biodisponibilité 3- fois plus élevée qui, curieusement, ne se traduit que par un effet néphroprotecteur légèrement supérieur. En accord, nous n'avons pas observé d'effet néphroprotecteur supplémentaire lorsque nous avons utilisé une dose plus élevée (c'est-à-dire 100 mg/kg) dequercétinedans des expériences précédentes (nos observations non publiées) [25,26]. Dans ces études, notre interprétation était que, probablement, des doses plus élevées dequercétine(i.e., >50 mg/kg) ne s'est pas traduit par une augmentation de la biodisponibilité en raison de la solubilité réduite, ce qui n'a entraîné aucune augmentation significative de l'absorption nette. Cela a coïncidé avec des dépôts jaunes de non absorbéquercétinetrouvé dans la cavité péritonéale au moment du sacrifice. De plus, nos présents résultats montrent que des concentrations plasmatiques de quercétine encore plus élevées (telles que celles obtenues avec la P-quercétine) ne se traduisent que par un effet légèrement plus élevé. Carquercétinedistribution a été expliquée sous une forme simplifiée par un modèle de premier ordre à deux compartiments [51], l'accès aux cellules cibles à partir du compartiment principal (c'est-à-dire la circulation sanguine) ne semble pas être la limitation. Ainsi, la raison pour laquelle l'effet néphroprotecteur maximal est presque atteint avec les concentrations plasmatiques plus faibles produites par la quercétine naturelle reste insaisissable.

Cela a des implications pratiques pour le développement ultérieur dequercétinecomme néphroprotecteur prophylactique. Tout d'abord, ces résultats ouvrent la possibilité d'étudier si des régimes de dosage plus faibles seront aussi efficaces, car un large excès de biodisponibilité de P-quercétinepeut être sacrifié sans perdre aucun effet thérapeutique mais maximisera le profil de sécurité. Deuxièmement, la possibilité est maintenant ouverte pour l'administration orale, qui doit néanmoins être testée pour la nouvelle formulation. L'absorption par la cavité péritonéale évite les barrières rencontrées par voie orale. On émet l'hypothèse que la solubilité plus élevée dans la lumière intestinale pourrait entraîner une augmentation et un durcissementquercétinebiodisponibilité dans la fenêtre thérapeutique. Troisièmement, la voie intraveineuse pourrait désormais être une alternative réaliste avec une toxicité minimisée, ce qui éviterait les barrières d'absorption. Jusqu'à présent, les formulations injectables expérimentales dequercétineont utilisé du diméthylsulfoxyde (DMSO) comme solvant [51].

Le cisplatine est connu pour s'accumuler et endommager les tubules proximaux et distaux et induire l'apoptose et la nécrose des cellules épithéliales des tubules, en fonction de la concentration [16]. Le segment S3 proximal est le plus touché, même si les segments S1 et S2 sont également de plus en plus endommagés par des doses plus élevées. En accord avec ses propriétés anti-apoptotiques connues sur les cellules tubulaires [52,53],quercétinedésépithélisation tubulaire corticale réduite. L'effet identique observé avec les deux formulations renforce l'idée que lequercétinecinétique de distribution à lareinssont saturés dans notre étude. Par ailleurs, au sein de lareins, quercétinemontre un comportement différent le long du néphron. En réalité,quercétinen'a eu aucun effet sur la moelle externe, où se trouve le segment S3 des tubules proximaux.Quercétinesemble s'accumuler dans les tubules S1, S2 ou distaux, situés près du cortex. Parce qu'on ne sait pas comment (c'est-à-dire quels transporteurs ou voies de diffusion) et d'où (c'est-à-dire le côté luminal ou basolatéral)quercétineaccède aux cellules tubulaires, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour expliquer ces effets différentiels.

La préservation modérée du tissu cortical peut n'expliquer qu'en partie l'effet dequercétinesur la fonction rénale (c'est-à-dire le DFG). Une protection supplémentaire peut provenir des effets vasculaires dequercétine. La fonction endothéliale participe à la régulation du débit sanguin rénal (RBF) et du DFG en modulant le tonus contractile des artérioles afférentes et efférentes [54-57]. Le cisplatine induit un dysfonctionnement endothélial, et on pense qu'il contribue de manière substantielle à la baisse du DFG, ainsi qu'à la vasoconstriction rénale afférente induite par les mécanismes de rétroaction tubuloglomérulaire (activés par les lésions tubulaires) et par les cytokines inflammatoires [13, 58]. En effet, l'inversion de la dysfonction endothéliale est un effet largement reconnu dequercétine(et des flavonoïdes en général)[59-61l, ce qui peut expliquer pourquoiquercétineaméliore le RBF (et donc le GFR), comme indiqué précédemment [25]. De plus, ces effets endothélio-vasculaires pourraient également contribuer à expliquer l'efficacité légèrement supérieure de la P-quercétineà améliorer la fonction rénale et la récupération de la fonction rénale. Il n'est probablement pas déraisonnable de supposer qu'une biodisponibilité plus élevée pourrait avoir un effet plus audacieux sur la cuve endothéliale en contact direct avec le sang.

Certains des effets observés après l'administration dequercétinepourrait être exercé par ses métabolites.Quercétineest métabolisé dans la muqueuse intestinale et le foie par des réactions de glucuronidation, sulfatation et méthylation [62], les métabolites les plus abondants étant les métabolites glucuronides dans le sang [63]. Spécifiquement,quercétineIl a été démontré que le -3-bO-glucuronide (Q3GA), un métabolite plasmatique majeur, exerce des effets anti-inflammatoires et vasculaires, à la fois directement et après métabolisation vers la forme aglycone [64]. Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour comprendre les métabolites spécifiques responsables de la neuroprotection et leur production différentielle et leur transformation à partir de différents sites d'administration vers leurs cibles finales.

En conclusion, cette première étude montre le potentiel thérapeutique de la P-quercétineen tant que formulation améliorée avec des propriétés biopharmaceutiques et pharmacocinétiques améliorées, utile pour un développement ultérieur et une utilisation clinique prospective dans la prophylaxie denéphrotoxicité.

Avantages de la quercétine sur la néphrotoxicité

4. Matériels et méthodes

Tous les produits chimiques et réactifs ont été achetés auprès de Merck (Darmstadt, Allemagne) sauf indication contraire.

4.1.Préparation de la Formulation Micellaire (P-quercétine) et le naturelQuercétineFormulation

Quercétinel'hydrate (pureté minimale de 95 pour cent) a été acquis auprès d'Acros Organics (Madrid, Espagne) et le copolymère séquencé d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène Pluronic F127 (poids moléculaire moyen 12,6 kDa, équilibre hydrophile-lipophile 22) a été fourni par BASF (Ludwigshafen am Rhein, Allemagne). Pour la formulation micellaire, la technique de précipitation antisolvant supercritique a été utilisée pour produirequercétine/Pulronic F127 particules (P-quercétine) comme décrit précédemment [31]. Le Pluronic résultantquercétineformulation avait une composition relative de 50 % /50 % p/p Pluronic F127/quercétine. Pour le naturelquercétineformulation,quercétinea été suspendu dans 0.16 % de Tween 20 dans une solution saline, comme décrit précédemment [25,26].

4.2. Animaux et bioéthique

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de Bioéthique de l'Université de Salamanque et le Gouvernement Régional de Castille et Leon, Ministère de l'Agriculture et de l'Élevage (code : 0000037, 27 juillet 2015). Les animaux ont été manipulés conformément aux directives de la directive 2010/63/UE du Conseil de la Communauté européenne et à la législation espagnole en vigueur relative à l'utilisation et aux soins des animaux d'expérimentation (RD53/2013, 01 février 2013). Des rats mâles Wis-tar (200-250 g) ont été maintenus dans des conditions environnementales contrôlées au sein de l'animalerie de l'Université de Salamanque, avec un accès gratuit à l'eau et à la nourriture standard.

4.3. Étude de biodisponibilité

Les rats ont été divisés en deux groupes expérimentaux : O (n=5), dans lesquels les animaux ont reçu une dose unique dequercétine(50 mg/kg); et PQ(n=5), dans lequel les animaux ont reçu une seule dose ip équimolaire de P-quercétine(100 mg/kg (c'est-à-dire contenant 50 mg/kgquercétine). Par la suite, des échantillons de sang ont été prélevés dans des tubes recouverts d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à partir d'une petite incision dans l'extrémité de la queue aux moments suivants :0.25,0.5,1,2,8, 12h et 24h. Le plasma a été obtenu par centrifugation et 10μL d'acide ascorbique 10 mM (pour éviterquercétinedégradation) a été ajouté à 100 μL de plasma et congelé à -80 degré jusqu'à son analyse.Quercétineles concentrations ont été déterminées par une méthode de chromatographie liquide à haute performance (CLHP) en phase inverse avec détection UV. Une colonne C18 Prosper de 3 um de granulométrie a été utilisée, avec une phase mobile composée de 28 % d'acétonitrile et de 72 % d'une solution aqueuse d'acide orthophosphorique 0,2 %, à un débit de 1 mL/min. La longueur d'onde de détection était de 371 nm. Avant l'injection dans l'équipement de chromatographie, les échantillons ont été soumis à un processus de glucuronidation pour la quantification du totalquercétine. À cette fin, 1000 unités de -glucuronidase de Helix pomatia dans un tampon acétate 0,1 M (pH 5) ont été ajoutées à 100 μL de plasma, et ce mélange a été incubé à 37 degrés pendant 1h . Ensuite, un processus d'extraction a été effectué avec 100 μL d'un mélange 0,5 M80∶20 acétonitrile/acétique (trois fois). Une fois le surnageant évaporé dans un flux d'azote, le résidu sec a été redissous dans la phase mobile de 40 μL et 20 μL ont été injectés dans le système HPLC.

4.4. Étude de néphroprotection

Les rats ont été répartis dans les groupes expérimentaux suivants (Figure 6) : les animaux témoins (n=3) ont reçu le véhicule (NaCl0.9 %) par voie intrapéritonéale (ip) pendant 9 jours ; Les animaux CP(n=5) ont reçu une seule dose néphrotoxique de cisplatine (6,5 mg/kg, ip) le jour 3 de l'expérience ; les animaux CP plus Q(n=5) ont reçu une dose quotidienne dequercétine(50 mg/kg, ip) pendant 9 jours et une dose unique de cisplatine (6,5 mg/kg, ip) le jour 3 ; et CP plus PQ (n=5)animaux ont reçu une dose quotidienne de P-quercétine(100 mg/kg, ip(c'est-à-dire contenant 50 mg/kgquercétine)) pendant 9 jours et une dose de cisplatine (6,5 mg/kg, ip) le jour 3.

Figure 6. Schéma du modèle de néphrotoxicité.

PC : cisplatine (6,5 mg/kg, ip) au jour 3 ; PC plus Q :quercétine(50 mg/kg, ip) pendant 9 jours et cisplatine (6,5 mg/kg, ip) le jour 3 ; CP plus PQ:P-quercétine(100 mg/kg, ip.) pendant 9 jours et cisplatine (6,5 mg/kg, ip) le jour 3.

Des échantillons de sang (150 μL) ont été prélevés aux jours 0, 3, 5, 7 et 9 dans des capillaires héparinés à partir d'une petite incision à l'extrémité de la queue. Le plasma a été séparé par centrifugation (11.000 rpm pendant 3 min) et maintenu à -80C. Aux jours 7 et 9, l'urine de 24 h a été recueillie dans des cages métaboliques, éliminée par centrifugation (2000 × g pendant 9 min) et stockée à -80 degré . A la fin de l'expérience (jour 9), les rats ont été anesthésiés et leurreinsont été disséqués, pesés et fixés dans du paraformaldéhyde à 3,7 % pour des études histologiques.

La créatinine plasmatique et urinaire a été mesurée à l'aide d'un kit commercial basé sur la méthode de Jaffe [65] (QuantiChrom Creatinine Assay Kit, BioAssay Systems, Hayward, CA, USA). L'urée plasmatique a été déterminée à l'aide d'un kit commercial basé sur la méthode de Jung [66] (Quan-tiChrom Urea Assay Kit, BioAssay Systems, Hayward, CA, USA). La clairance de la créatinine (Clcr) a été calculée à l'aide de la formule : Clcr=Crur × UF/ Crp) ; où Crur correspond à la concentration urinaire de créatinine, UF est le débit urinaire et Crp est la concentration plasmatique de créatinine. La protéinurie a été mesurée avec le test de Bradford [67]. KIM-1 a été quantifié à l'aide du RatUn reinblessureMolécule 1(KIM-1)Kit ELISA (Cusabio, Houston. TX, USA). suivant les instructions du fabricant.

Pour les études histologiques, des échantillons rénaux ont été inclus dans de la paraffine et des coupes de tissu de 5 um ont été colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine. Les photographies ont été prises sous un microscope Olympus BX51 connecté à un appareil photo numérique couleur Olympus DP70 (Olympus, Madrid, Espagne). La quantification des dommages a été effectuée en aveugle comme décrit précédemment [68]. En bref, cinq photographies aléatoires de la région corticale et cinq photographies de la région médullaire externe (c'est-à-dire les zones endommagées par le cisplatine) ont été prises, cartographiant uniformément ces zones. Chaque image a été divisée en 10 sections identiques (à l'aide du logiciel Microsoft Office PowerPoint 2016), chacune d'elles s'est vu attribuer un score de 0 (aucun dommage), 1 (présence de dommages dans moins d'1/3 de la zone), 2 (présence de dommages entre 1/3-2/3 de la surface), ou 3 (présence de dégâts sur plus de 2/3 de la surface). Les dommages ont été évalués en tenant compte de la présence d'une nécrose tubulaire et d'une desquamation cellulaire, d'une dilatation tubulaire, d'une vacuolisation, de la présence de dépôts hyalins et de la perte de la bordure en brosse.

4.5.Analyse statistique

Les données sont présentées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). Les valeurs aberrantes ont été identifiées à l'aide du test de Grubbs|69]. La distribution normale des données a été évaluée à l'aide du test de Shapiro-Wilk. Dans l'étude de biodisponibilité, la comparaison entre les deux groupes a été faite à l'aide du test t de Student ou du test U de Mann-Whitney. L'étude pharmacocinétique a été réalisée au moyen d'une analyse indépendante du modèle des taux plasmatiques moyens dequercétine. Les paramètres estimés pour évaluer la biodisponibilité relative desquercétineétaient l'aire sous la courbe partielle des taux plasmatiques (AUC)24, l'aire sous la courbe totale des taux plasmatiques (AUC)0~, la pente de la phase terminale, la demi-vie d'élimination (ti/2) , et le temps de séjour moyen (MRT). L'estimation des paramètres pharmacocinétiques a été réalisée en combinant la méthode trapézoïdale pour l'estimation de l'aire sous la courbe partielle et la régression non linéaire de la phase terminale de la courbe de niveau plasmatique. Pour l'étude de néphroprotection, une analyse de variance (ANOVA) avec des tests de Scheffe ou un test de Kruskal-Wallis a été réalisée pour les comparaisons inter-groupes. L'analyse statistique a été réalisée avec le logiciel IBM SPSS Statistics 20.0 (International Business Machines, Armonk, NY, USA). Microsoft Office Excel et PowerPoint 2016 (Microsoft, Redmond, WA, États-Unis) ont été utilisés pour créer les illustrations et les illustrations.

Références

1. Awdishu, L. ; Mehta, RLThe6R's of Drug-InducedNéphrotoxicité. BMCNephrol.2017,18,124. [CrossRefl[PubMed]

2. Perazella, MADusage de drogues etNéphrotoxicitédans l'unité de soins intensifs.Un reinInt.2012,81,1172-1178. [Référence croisée] [PubMed]

3. Taber, SS;Mueller, Dysfonctionnement rénal associé à un médicament. Crit.Care Clin.2006,22,357-374, vi. [CrossRef] Huang, JX ; Blaskovich, MA; Cooper, MACell et les tests basés sur les biomarqueurs pour la prédictionNéphrotoxicité.

Noter:ce qui précède n'est pas une liste de référence complète