Variation de l'expression génique entre deux lignées bicolores de sorgho différant par la réponse de l'immunité innée

Abstrait:

L'immunité déclenchée par le modèle moléculaire associé aux microbes (MAMP) (MTI) est un élément clé de la réponse immunitaire innée de la plante à la reconnaissance microbienne. Cependant, la plupart de nos connaissances actuelles sur le MTI proviennent de plantes modèles (c'est-à-dire Arabidopsis thaliana) avec relativement moins de travail effectué à l'aide de plantes cultivées. Dans ce travail, nous avons étudié la salve oxydative (ROS) déclenchée par MAMP et la réponse transcriptionnelle dans deux génotypes bicolores de sorgho, BTx623 et SC155-14E. SC155-14E est une lignée qui présente une résistance élevée à l'anthracnose et la lignée BTx623 est sensible à l'anthracnose. Nos résultats ont révélé une nette variation de l'expression des gènes et des ROS en réponse à l'élicitation de la flagelline (flg22) ou de la chitine entre les deux lignées. Alors que la réponse transcriptionnelle à chaque MAMP et dans chaque lignée était unique, il y avait un degré considérable de chevauchement, et nous avons pu définir un ensemble de gènes de base associés à la réponse transcriptionnelle MAMP du sorgho. L'analyse de l'enrichissement du terme GO et de la voie KEGG a découvert plus de DEG liés à l'immunité et à la résistance aux agents pathogènes dans les échantillons SC155-14E traités au MAMP que dans le BTx623 avec le même traitement. Les résultats fournissent une base de référence pour de futures études visant à étudier les voies de l'immunité innée dans le sorgho, y compris les efforts visant à améliorer la résistance aux maladies.

Cliquez pour acheter unproduit d'immunité amélioré

    For more information:1950477648nn@gmail.com

Mots clés:

Sorgho bicolore; RSO ; l'immunité innée; les MAMP ; ARN-seq ; l'expression du gène

1. Introduction

Les plantes sont naturellement exposées à une variété de stress, y compris de nombreux pathogènes bactériens, fongiques et viraux [1]. Les plantes se protègent contre les agents pathogènes en utilisant des structures préformées et des produits chimiques, et des réponses induites par les infections du système immunitaire. Le système immunitaire des plantes utilise un système de perception à deux niveaux avec deux couches interconnectées de récepteurs.

Le premier niveau est activé par des récepteurs de reconnaissance de formes localisés en surface (PRR), qui détectent les molécules à l'extérieur de la cellule en reconnaissant l'agent pathogène envahissant grâce à la détection de motifs structurels conservés, appelés Microbe-Associated Molecular Patterns (MAMP), qui déclenchent une mais large, réponse de défense [2]. La flagelline, la chitine, les lipopolysaccharides, les peptidoglycanes (PGN) et le facteur d'élongation Tu sont des exemples de MAMP bien étudiés [3–5]. Cette réponse de défense est appelée immunité déclenchée par MAMP (MTI) [6]. Le deuxième niveau de défense connu sous le nom d'immunité déclenchée par l'effecteur (ETI) se produit en réponse à des protéines effectrices spécifiques dérivées d'agents pathogènes qui sont reconnues par la plante grâce à l'action de protéines de résistance, ce qui entraîne une réponse immunitaire forte mais hautement spécifique. L'ETI peut souvent être reconnue par l'induction d'une mort cellulaire localisée appelée réponse d'hypersensibilité (HR) [7]. Les systèmes MTI et ETI détectent les agents pathogènes et réagissent en activant les défenses antimicrobiennes dans la cellule infectée et les cellules voisines [3,8]. Les plantes portent également des récepteurs immunitaires qui reconnaissent des effecteurs pathogènes très variables, notamment la classe de protéines NBS-LRR [9].

De plus, la résistance systémique acquise (SAR) est une réponse de résistance « de la plante entière » qui se produit suite à une exposition localisée antérieure à un agent pathogène. Le SAR est associé à l'induction d'un large éventail de gènes (gènes liés à la pathogenèse), et l'activation du SAR nécessite l'accumulation d'acide salicylique endogène (SA) [10].

Des études principalement réalisées à l'aide d'Arabidopsis ont montré que le MTI peut provoquer diverses réponses, notamment des modifications de la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), de la production d'espèces réactives de l'azote telles que l'oxyde nitrique (NO), des dépôts de callose, des niveaux de calcium intracellulaire, du flux d'ions à travers le plasma. membrane, induction ou répression de l'expression de plusieurs gènes liés à la défense des plantes, altérations de la paroi cellulaire végétale, induction de composés antimicrobiens et synthèse de protéines liées à la pathogenèse (PR) [3,11].

Bien que plusieurs de ces réponses MTI puissent être considérées comme des réponses générales des plantes, leur ampleur peut être spécifique à l'espèce végétale et même spécifique au cultivar [12–17]. Des méthodes ont été développées pour quantifier la réponse MTI de la plante. Ces méthodes comprennent la mesure de la production de ROS ou de NO, la phosphorylation de la protéine kinase activée par un mitogène, l'expression génique spécifique induite par le MAMP, l'inhibition de la croissance des semis, la lignine et les phénols liés à la paroi cellulaire et la résistance induite par le MAMP aux agents pathogènes bactériens et fongiques [18-20].

Le sorghum bicolor (L.) Moench est une culture céréalière mondiale clé qui a été adaptée à une gamme d'habitats et sélectionnée à des fins diverses [21]. La culture du sorgho devrait augmenter considérablement dans le monde entier en tant que l'une des principales cultures pour la production d'aliments et de biomasse [22].

Au fur et à mesure que les pratiques et les zones géographiques de culture du sorgho augmentent, il est inévitable que la pression de la maladie augmente. Le sorgho se distingue des autres céréales par son éventail exceptionnellement large de maladies, qui est l'une des contraintes les plus importantes à sa production. À l'échelle mondiale, les maladies fongiques répandues sont les maladies du sorgho les plus destructrices qui entraînent d'énormes pertes de rendement, tant en termes de quantité que de qualité des grains [23]. L'anthracnose est l'une des maladies fongiques les plus graves affectant le rendement en grains du sorgho et la production de biomasse. Les pertes de rendement dues à ce pathogène peuvent être de 50 à 70 pour cent chez les cultivars sensibles [24,25]. Les plantes ont développé diverses stratégies de défense pour lutter contre l'invasion de pathogènes. Dans le sorgho, ces stratégies incluent l'activation des protéines PR [26], l'accumulation de peroxyde d'hydrogène [27] et la biosynthèse des phytoalexines flavonoïdes [28]. Différentes approches ont été utilisées pour étudier les réponses de résistance du sorgho, identifier les composés de défense et identifier les barrières physiques contre l'anthracnose (voir référence [29,30] pour un examen). Les études d'expression génique ont été largement utilisées pour identifier les gènes de résistance candidats chez les plantes sur la base de l'expression différentielle entre les cultivars résistants et sensibles ou les plantes non inoculées et inoculées par des agents pathogènes (par exemple, les références [31–37]). Wang et al., [37] ont effectué une analyse transcriptomique pour étudier la réponse du cultivar de sorgho BTx623 à C. subline-ola. Ils ont rapporté que les gènes impliqués dans le métabolisme des phénylpropanoïdes et la biosynthèse des métabolites secondaires ont été identifiés comme exprimés de manière différentielle en réponse à l'infection par l'agent pathogène par rapport aux plantes témoins non inoculées.

Cependant, ces expériences ont été menées avec des semis du cultivar sensible BTx623. Des études transcriptomiques supplémentaires pour comparer la réponse de l'expression génique à un agent pathogène dans les cultivars de sorgho sensibles et résistants seraient utiles. Par conséquent, il est important de comprendre l'architecture génétique contrôlant la résistance aux maladies basales du sorgho et son lien avec la résistance quantitative aux maladies.

Comme première étape dans cette direction, nous avons récemment criblé un ensemble de matériel génétique de sorgho diversifié pour la variation de leur réponse à l'élicitation de flg22 et de la chitine, ainsi que la résistance aux maladies fongiques [38]. Dans ce cas, MTI a été quantifié en mesurant la production de ROS lors de l'élicitation de MAMP. Parmi les résultats de cette étude antérieure, il y avait l'identification des génotypes de sorgho qui ont montré une réponse forte ou faible à l'élicitation du MAMP.

Le séquençage à haut débit de nouvelle génération et l'étude des transcriptomes peuvent aider à clarifier les réponses aux infections fongiques chez les plantes et à mieux comprendre les réponses de l'hôte. Les analyses du transcriptome ont été largement utilisées pour étudier les réponses des plantes à l'infection fongique chez de nombreuses espèces végétales, y compris les cultures céréalières (par exemple, les références [31-37]).

Cependant, les données publiées sur l'analyse comparative du transcriptome des cultures céréalières se sont principalement concentrées sur la réponse à divers agents pathogènes. Dans le sorgho, plusieurs publications ont porté sur des comparaisons de transcriptomes de plantes traitées avec divers agents pathogènes, dont l'anthracnose [35,37]. Certaines publications antérieures suggéraient qu'il n'y avait pas de corrélation significative entre la réponse aux MAMP et les maladies fongiques. Par exemple, Zhang et al. [17] ont rapporté une forte corrélation entre la réponse à deux MAMP flg22 et la chitine dans une population de cartographie de maïs, mais aucune correspondance avec la réponse à la maladie fongique. Kimball et al. [38] ont également rapporté une faible corrélation entre les scores de réponse ROS induits par flg22- et les scores de résistance aux taches foliaires cibles dans deux populations RIL de sorgho, y compris une population BTx623/SC155-14E. Par conséquent, compte tenu de la rareté des données, nous avons estimé qu'il était important de profiler de manière transcriptionnelle la réponse du sorgho aux traitements MAMP.

Dans le présent rapport, nous étendons notre analyse antérieure en mesurant la réponse transcriptionnelle globale à l'élicitation de MAMP. Nous avons utilisé l'analyse de séquençage d'ARN basée sur Illumina pour étudier les changements transcriptionnels en réponse au traitement par flg22 ou chitine dans les génotypes de sorgho BTx623 et SC155-14E, que nous avons précédemment caractérisés respectivement comme des répondeurs MTI faibles et forts, respectivement. BTx623 est la lignée de référence du génome de Sorghum bicolor [22] et SC155-14E est une lignée présentant une résistance élevée à l'anthracnose [39]. Patil et al. [39] ont rapporté que SC155-14E présentait un niveau élevé de résistance stable (presque sans maladie) à l'anthracnose dans tous les environnements testés, tandis que BTx623 était sensible à cette maladie fongique. Notre analyse ARN-seq a identifié 5252 et 8085 gènes différentiellement exprimés (DEG) dans BTx623 traités avec flg22 et chitine, respectivement, et 3849 et 5786 DEG dans flg22 et chitine traité SC155-14E, respectivement, par rapport aux contrôles fictifs non traités de ces deux génotypes.

De plus, une comparaison des DEG sélectionnés à l'aide de deux pipelines bioinformatiques différents a montré des résultats très similaires. Les profils d'expression des gènes exprimés de manière différentielle, l'analyse de l'enrichissement de l'ontologie génique (GO) et l'analyse de l'enrichissement de la voie KEGG ont montré une variation claire basée sur le génotype dans l'expression des gènes liés au MTI. Les résultats de l'enrichissement du terme GO et de la voie KEGG ont révélé davantage de DEG liés à l'immunité et à la résistance aux agents pathogènes (gènes PR, réponse des gènes à la chitine, réponse des gènes à l'acide salicylique, réponse des gènes au stress, etc.) présentés dans le SC traité au MAMP{{4} } E échantillons par rapport au BTx623 traité au MAMP. Les résultats fournissent une base pour identifier les différents composants de la réponse MTI du sorgho.

2. Résultats et discussion

2.1. Variation de la poussée oxydative dans différentes feuilles de sorgho

Notre analyse précédente de la réponse MTI de divers génotypes de sorgho a révélé une variation significative de la poussée oxydative déclenchée par le MAMP entre les génotypes BTx623 et SC155-14E [38]. De plus, SC155-14E est une lignée présentant une forte résistance à l'anthracnose, tandis que la lignée BTx623 est sensible à l'anthracnose [39]. C'est pour ces raisons que ces deux génotypes ont été choisis pour comparaison à l'aide d'ARN-seq.

Lors des premières mesures de ROS, nous avons trouvé une variation significative même au sein de la même plante, ce qui nous a amenés à étudier plus attentivement la source de cette variation. Plus précisément, nous avons testé la production de ROS en utilisant trois ensembles de feuilles, allant du bas vers le haut de plantes BTx623 et SC155-14E âgées de quinze jours. Les feuilles ont été marquées comme # 1, # 2 et # 3, de bas en haut, comme illustré à la figure 1A. Les résultats du test ROS (Figure 1B) ont révélé que : (1) le niveau de production de ROS était plus faible dans les feuilles les plus âgées (feuille n ° 1), tandis que les niveaux les plus élevés de production de ROS en réponse à flg22 ou à la chitine provenaient des feuilles les plus jeunes ( feuille #3). (2) Les BTx623 2 et les feuilles les plus jeunes (feuille n° 2) traitées au MAMP et non traitées ont produit des niveaux relativement faibles de production de ROS.

En revanche, les 2èmes feuilles les plus jeunes de SC155-14E traitées au MAMP ont produit des niveaux de production de ROS significativement (au niveau 0.01) plus élevés que le faux non traité, ainsi que le traité ou le faux de BTx{ {5}}e plus jeunes feuilles. (3) La poussée oxydative déclenchée par les applications de flg22 ou de chitine a été détectée dans les disques foliaires des feuilles les plus jeunes (feuille n ° 3) des deux génotypes, bien que, comme observé précédemment, les niveaux de production de ROS étaient plus élevés dans le SC traité au MAMP. 155-14E par rapport à BTx623. L'évolution dans le temps de la production de ROS déclenchée par flg22- et déclenchée par la chitine dans SC 155-14 E 2ème feuille la plus jeune a révélé que la production de ROS déclenchée par la chitine s'est produite plus tôt que la production de ROS déclenchée par flg22- (Figure 1C ). Des résultats similaires ont été rapportés par Zhang et al. [17] où la production de ROS déclenchée par la chitine est apparue plus tôt que la production de ROS déclenchée par flg22- dans les semis de maïs traités par flg22 et chitine. Il a été rapporté [40] que la production de ROS en réponse à flg22 montrait la production la plus élevée de ROS autour de 12 min et était la plus faible à 30 min chez Arabidopsis. Les résultats de notre test ROS dans le sorgho ont montré la production de ROS la plus élevée autour de 13 min et la plus faible à 30 min après le traitement au flg22, ce qui est très similaire aux résultats chez Arabidopsis. Puisque notre objectif était de trouver les conditions optimales pour la comparaison de la réponse MTI des deux génotypes, nous avons choisi les 2èmes feuilles les plus jeunes de 15- plantes âgées d'un jour pour l'extraction de l'ARN et l'analyse transcriptomique ultérieure. La variation entre les feuilles de plantes de sorgho individuelles rappelle que les résultats peuvent varier entre les expériences en fonction de la source, du moment et d'autres caractéristiques d'une expérience donnée et, par conséquent, que les paramètres expérimentaux doivent être soigneusement contrôlés.

L'explosion oxydative, une production rapide et transitoire d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), est l'un des premiers aspects observables de la réponse de défense d'une plante [41]. Considérant que le sursaut de ROS est une réponse immédiate, une réponse transcriptionnelle légèrement plus tardive des gènes liés au MTI est attendue. Nous avons récolté des échantillons 60 min après le traitement des MAMP pour l'analyse de l'ARN-Seq.

2.2. Gènes différentiellement exprimés (DEG) de BTx623 et SC155-14E en réponse aux traitements MAMP

Pour évaluer le niveau d'expression des gènes annotés codant pour la protéine Sorghum bicolor pour chaque échantillon, le nombre de lectures propres d'ARN-seq cartographié à chaque gène a été calculé puis normalisé en FPKM (fragments par modèle d'exon kb par million de fragments cartographiés). Les changements d'expression de chaque gène dans les disques foliaires traités au MAMP de BTx623 et SC155-14E par rapport aux traitements fictifs (à l'eau) ont été étudiés. Le nombre total de gènes exprimés était similaire dans tous les traitements des deux génotypes : 27 171, 27 283, 27 161, 27 182, 27 512 et 27 175 gènes exprimés dans la simulation de BTx623, flg22-BTx623 traité, BTx623 traité à la chitine, simulation de SC{ {22}}E, flg22-SC traité155-14E et SC155-14E traité à la chitine, respectivement. Nous avons utilisé le génome de référence BTx623 pour le mappage de lecture dans les deux lignées car la référence spécifique pour SC155-14E n'est pas disponible. Les numéros de gènes exprimés extraits de BTx623 et SC{{30}}E avec toutes les conditions ci-dessus ont révélé que les deux lignées partageaient des nombres similaires de gènes exprimés. Les taux globaux de mappage de lecture des échantillons de SC155- 14E mock (3 répétitions), SC155-14E traité avec flg22 (3 répétitions), SC155-14E traité avec de la chitine (3 répétitions) , BTx623 mock (3 répétitions), BTx623 traité avec flg22 (3 répétitions), BTx623 traité avec de la chitine (3 répétitions) étaient : 93,6 % , 93,9 % , 93,9 % , 93,8 % , 93,9 % , 93,6 % , 93,5 % , 93,5 % , 93,1 % , 96,9 % , 97,0 % , 97,0 % , 97,2 % , 96,8 % , 97,0 % , 96,9 % , 97.0 pour cent , 97,0 pour cent , respectivement. Ces résultats suggèrent que les différents effets du traitement aux MAMP sur les transcriptomes de BTx623 et SC155-14E n'étaient pas dus aux différences de séquence génomique entre les deux génotypes

Le tracé PCA de l'expression génique donne un aperçu de l'association entre les échantillons. Pour explorer la similitude de nos échantillons, nous avons effectué une analyse PCA. Le tracé d'échantillons sur le PC1 et le PC2 (Figure 2) a montré que quatre conditions expérimentales (BTX623_flg22 ; SC155-14E_flg22 flg22 ; BTX623_chitine et SC{ {10}}E_chitine) étaient largement séparés. En revanche, les trois répliques biologiques de chaque lignée de sorgho et de chaque traitement MAMP, ainsi que le traitement simulé, étaient étroitement regroupées, respectivement, indiquant une bonne reproductibilité entre les répliques biologiques (Figure 2).

Les parcelles de volcan de la figure 3 montrent l'expression des gènes dans les deux lignées de sorgho traitées avec du flg22 ou de la chitine. Un diagramme de volcan est un type de nuage de points qui montre la signification statistique (valeur p) par rapport à l'ampleur du changement (changement de facteur). Il permet une identification visuelle rapide des gènes présentant des modifications importantes qui sont également statistiquement significatives. Ceux-ci peuvent être les gènes les plus significatifs sur le plan biologique. Dans la figure 3, les gènes avec −log10 (valeur de p) égal ou supérieur à 3 sont considérés comme des DEG. Les points de couleur rouge représentent les DEG et les points de couleur noire représentent les non-DEG. Dans chaque graphique, les gènes avec log2 (fold_changement) supérieur à 0 sont des gènes régulés positivement, sinon des gènes régulés négativement. Les gènes les plus régulés à la hausse sont vers la droite, les gènes les plus régulés à la baisse sont vers la gauche et les gènes les plus statistiquement significatifs sont vers le haut.

Les gènes différentiellement exprimés (DEG) ont été sélectionnés à partir de chaque traitement en fonction de leur signification d'expression (valeur de p 0.001). Il convient de noter que nous avons utilisé une valeur p de 0.001 comme seuil, mais pas FDR (valeurs q) pour sélectionner les DEG dans ce rapport. Les FDR (valeurs q) étaient également significatifs à ce niveau (tableaux S2 à S5). À une valeur p de 0.001, les FDR étaient de 0,0039, 0,0051, 0,0025 et 0,0035 pour BTx623 avec traitement flg22, SC155-14E avec traitement flg22, BTx623 avec traitement chitine et SC{{ 26}}E avec traitement à la chitine, respectivement. Les valeurs p et q des gènes de BTx623 et SC155-14E dans toutes les conditions sont répertoriées dans les tableaux S2 à S5. En analysant les modèles d'expression de ces gènes dans les feuilles traitées au MAMP de BTx623 et SC155-14E, nous avons observé un grand nombre de gènes (14 à 30 % du total des gènes exprimés) qui présentaient de grandes différences après flg22 ou chitine traitement dans les deux lignées de sorgho. Le nombre de DEG totaux de BTx623 traité à la chitine (8085) était très proche de celui rapporté dans une précédente étude de transcriptome chez BTx623 infecté par l'agent pathogène de l'anthracnose C. subline-ola (8078) [37]. Le nombre de DEG était plus élevé dans les feuilles BTx623 traitées avec flg22 (19 %) ou chitine (30 %) par rapport à SC155-14E (14 % et 21 %, respectivement).

Bien que le nombre plus élevé de DEG dans le BTx623 traité au MAMP par rapport au SC 155-14 E était opposé à la réponse ROS de ces deux génotypes, cela n'est peut-être pas surprenant puisque la réponse ROS et la réponse d'expression génique au traitement MAMP se produisent à différents moments, sont largement indépendants et sont véhiculés par des mécanismes différents [42,43]. L'enrichissement du terme GO et de la voie KEGG a révélé davantage de DEG liés à l'immunité et à la résistance aux agents pathogènes présentés dans les échantillons SC155-14E traités au MAMP. De plus, le fait que le nombre de DEG était plus élevé dans les échantillons traités à la chitine par rapport à ceux traités avec flg22 correspondait bien aux tests de réponse ROS (Figure 1B) où nous avons constaté une réponse ROS plus forte lors du traitement à la chitine.

Pour étudier dans quelle mesure les gènes et les processus biologiques sont partagés entre les traitements flg22 et chitine dans BTx623 et SC155-14E, nous avons comparé leurs DEG plus en détail. Les diagrammes de Venn de la figure 4A montrent le chevauchement des DEG dans le total, les ensembles de gènes régulés à la hausse et à la baisse à une valeur p de 0.001. Sur un total de 10 535 DEG, un ensemble de base de 2 272 gènes a répondu à la fois au flg22 et au traitement à la chitine dans les deux lignées de sorgho. De même, sur un total de 5410 gènes régulés à la hausse, un ensemble de base de 1778 gènes a été régulé à la hausse dans les deux génotypes, tandis que, sur un total de 5125 gènes régulés à la baisse, un ensemble de base de 474 gènes a été régulé à la baisse dans les deux génotypes. génotypes.

Les données de séquence d'ARN présentées ici ont été analysées à l'aide du pipeline bioinformatique avec les outils Bowtie2 2.3.4.3, TopHat 2.1.1 et Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) avec les paramètres par défaut (pipeline n° 1). Pour confirmer davantage les résultats du test, nous avons utilisé un autre pipeline (pipeline #2) avec HiSat2, HTSeq et edgeR pour effectuer l'analyse. HiSat2 est le prochain développement de TopHat2. Nous avons comparé les DEG de chaque condition (c'est-à-dire deux génotypes traités avec flg22 ou chitine, tous, DEG régulés à la hausse ou à la baisse) sélectionnés à l'aide des deux pipelines. Les résultats (Figure 5) ont montré que les nombres DEG sélectionnés à l'aide des deux pipelines étaient très proches.

Le nombre total de DEG sélectionnés avec le pipeline n° 1 par rapport au pipeline n° 2 était BTx623_flg22 : 5 241 contre 5 413 ; SC155-14E_flg22 : 3849 contre 3476 ; BTx623_chitine : 8 085 contre 8 320 ; SC155-14E_chitine : 5 786 contre 5 383. Les DEG régulés à la hausse sélectionnés avec le pipeline n° 1 contre le pipeline n° 2 étaient BTx623_flg22 : 3 074 contre 3 076 ; SC155-14E_flg22 : 2591 contre 2483 ; BTx623_chitine : 4 156 contre 4 583 ; SC155-14E_chitine : 3 486 contre 3 346. Les DEG régulés à la baisse sélectionnés avec le pipeline n° 1 contre le pipeline n° 2 étaient BTx623_flg22 : 2 152 contre 2 237 ; SC155-14E_flg22 : 1257 contre 993 ; BTx623_chitine : 3 919 contre 3 757 ; SC155-14E_chitine : 2296 contre 2037. De plus, les résultats de la figure 5 ont également révélé qu'un pourcentage élevé de DEG sélectionnés à l'aide des deux pipelines se chevauchaient dans toutes les conditions. Le pourcentage de numéros DEG/numéros DEG superposés sélectionnés à l'aide du pipeline n° 1 était de 79,6 % et 73,7 %. 80,8 % et 74,4 % du total des DEG de BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_chitine et SC155-14E{{73} }chitine, respectivement ; 83 %, 80,6 %, 85,3 % et 81,1 % des DEG régulés à la hausse de BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_chitine et SC{{ 88}}E_chitine, respectivement ; 75,1 %, 59,5 %, 75,8 % et 67,4 % des DEG régulés à la baisse de BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_chitine et SC{{ 105}}E_chitine, respectivement. Ainsi, ces résultats comparatifs ont prouvé que les données de séquence d'ARN présentées sont correctes, quelle que soit la méthode utilisée pour l'analyse.

La carte thermique des profils d'expression en cluster des DEG de BTx623 et SC 155-14 E traités avec flg22 ou chitine pour les trois réplicats biologiques est illustrée à la figure 6. Les valeurs d'expression génique ont été normalisées en tant que scores z. La couleur passe du violet au rouge à mesure que la valeur augmente, indiquant l'expression du gène de faible à élevée. Cette carte thermique montre clairement la régulation différentielle des gènes dans BTx623 et SC155-14E en réponse au flg22 ou au traitement à la chitine. De plus, les résultats montrent également que les cartes thermiques de trois répétitions biologiques dans chaque condition étaient très proches, indiquant une bonne reproductibilité entre les répétitions biologiques.

De plus, des comparaisons par paires (figure 7A) entre les DEG régulés à la hausse et à la baisse des traitements flg22 et chitine ont montré qu'il y avait un grand chevauchement entre BTx623 et SC155-14E. Parmi les 3 074 gènes induits par flg22- dans BTx623, 83,8 % ont également été induits dans BTx623 en réponse à un traitement à la chitine, tandis que sur les 2 591 gènes induits par flg22- dans SC155-14E, {{ 16}},6 % ont également répondu au SC155-14E traité à la chitine. Ce n'est peut-être pas surprenant puisque des travaux antérieurs sur Arabidopsis thaliana ont montré un chevauchement significatif des gènes répondant à une variété de MAMP distincts, qui définissent les voies générales du MTI [44–46].

De plus, Zhang et al. [17] ont également rapporté une corrélation significative entre flg22 et la réponse de la chitine chez le maïs. Moins de chevauchement a été observé entre les disques de feuilles BTx623 et SC 155-14 E traités avec le même MAMP (figure 7A). 64,3 % des gènes induits par flg22- dans BTx623 ont été induits dans flg22-SC155-14E traité et 68,3 % des gènes induits par la chitine dans BTx623 ont été induits dans SC traité par chitine155-14 E. De même, sur les 2152 gènes régulés à la baisse lors du traitement flg22 de BTx623, un pourcentage élevé (75,9%) ont également été régulés à la baisse par la chitine dans BTx623. Sur 1 257 gènes régulés négativement par flg22 dans SC155-14E, 70,8 % étaient également régulés négativement par la chitine dans SC155-14E. Cependant, seuls 29 % des gènes flg22 régulés à la baisse dans BTx623 étaient également régulés à la baisse dans flg22-SC155-14E traité et 45 % des gènes régulés à la baisse par la chitine dans BTx623 étaient régulés à la baisse. dans SC155-14E traité à la chitine (figure 7A). Par conséquent, bien qu'il y ait eu une convergence significative des voies MTI vers flg22 et la chitine dans les deux génotypes comparés, les données suggèrent également une complexité intéressante sur la façon dont ces deux génotypes répondent à différents MAMP.

2.3. Analyse de l'enrichissement fonctionnel des gènes comparant la réponse MTI de BTx623 et SC155-14E

Pour déterminer les catégories fonctionnelles de gènes régulés en réponse à flg22 ou à la chitine et la réponse différentielle des deux lignées de sorgho testées, nous avons utilisé la plate-forme PlantRegMap [47,48] pour effectuer une analyse d'enrichissement de l'ensemble de gènes basée sur les DEG détectés dans le système biologique. catégorie de processus. Les figures 8A et B montrent les principaux termes GO des gènes enrichis en processus biologiques avec des DEG régulés à la hausse et des DEG régulés à la baisse de BTx623 et SC155-14E. La liste complète des DEG est fournie dans les tableaux S6 à S13. Beaucoup de ces gènes sont associés à des processus tels que la réponse au stress, les réponses de défense des plantes, la réponse au stimulus, la réponse au stimulus biotique, la réponse à la bactérie, la réponse à un autre organisme, la communication cellulaire, le processus métabolique du phosphore et la phosphorylation des protéines.

Les résultats de la figure 8A et B montrent des différences claires dans l'expression des gènes normalement associés à l'immunité innée entre les deux génotypes de sorgho. Dans ces termes GO enrichis, certains DEG uniques ont été trouvés dans chaque condition avec chevauchement. Par exemple, la réponse de défense du terme GO (GO 0006952) : 91 et 84 DEG régulés positivement ont été enrichis en BTx623 ou SC155-14E traités avec flg22, respectivement. Au sein de ces DEG, 24 DEG étaient uniques dans BTx623 et 15 DEG n'ont été trouvés que dans SC155-14E, et les autres ont été présentés dans les deux génotypes de sorgho. De même, 102 et 93 DEG régulés positivement ont été enrichis en BTx623 ou SC155-14E traités avec de la chitine, respectivement. Parmi ces DEG, 20 DEG étaient uniques dans BTx623 et 14 DEG étaient uniques dans SC155-14E, et les autres étaient présentés dans les deux génotypes de sorgho.

Dans le terme GO de "réponse à la chitine (GO : 0010200)", nous avons observé 18 DEG régulés positivement sur un total de 779 gènes de cette catégorie enrichis dans les échantillons SC155-14E traités à la chitine (Figure 8 ), alors qu'aucun gène n'a été enrichi dans les échantillons de BTx623 traités à la chitine. De plus, 16 DEG régulés positivement ont été enrichis en échantillons SC155-14E traités par flg22-, et 12 DEG régulés positivement ont été enrichis en échantillons BTx623 traités par flg22- (Figure 8). La comparaison des listes DEG du terme GO "réponse à la chitine" dans flg22 et BTX623 et SC155-14E traités à la chitine (tableau S9) a révélé que les DEG enrichis en flg22 ou SC traité à la chitine155- 14 E étaient les mêmes sauf que la chitine induisait deux DEG de plus que flg22. En revanche, les 12 DEG enrichis en flg22-BTX623 traité étaient différents des DEG induits par les MAMP dans SC155-14E. Ces DEG induits par les MAMP peuvent contribuer à la réponse de résistance de l'anthracnose dans SC155-14E puisque la chitine est une molécule MAMP typique des parois cellulaires fongiques qui provoque des réponses immunitaires végétales. Stringlis et al. [49] ont également rapporté qu'un ensemble de DEG régulés à la hausse étaient enrichis en terme GO de "réponse à la chitine" de la chitine, flg22, et une rhizobactérie bénéfique pour les plantes Pseudomonas simiae WCS417 a traité des plantes Arabidopsis. Matic et al. [33] ont rapporté que 21 DEG étaient enrichis du terme GO de "réponse à la chitine" à partir de l'analyse ARN-seq de la feuille de riz d'un cultivar résistant mais pas d'un cultivar sensible après infection par le pathogène fongique Fusarium fujikuroi.

Les gènes PR (Pathogenesis-related) sont impliqués dans la réponse immunitaire des plantes [50] et ont une activité antifongique contre de nombreux champignons phytopathogènes [51]. Les protéines PR-10 sont de petites protéines intracellulaires principalement acides avec des propriétés antifongiques qui ont été associées à des réponses de défense chez des espèces végétales, y compris le sorgho [52]. Les membres de la famille des gènes PR-10 ont été induits par des attaques d'agents pathogènes dans une grande variété d'espèces végétales [53]. Dans le sorgho, Lo et al. [26] ont rapporté que l'expression de PR-10 était induite dans le cadre de la défense active de l'hôte du sorgho contre les pathogènes fongiques foliaires C. heterostrophus et C. sublineolum. Katie et al. [54] ont rapporté que plusieurs cultivars de sorgho présentaient une induction significative de quantités relatives normalisées de PR-10 après inoculation avec des spores fongiques de C. lunata et F. capsicum lors d'essais sur le terrain. En serre, les glumes des plantes inoculées ont montré une induction de l'ARNm de PR-10, et la réponse était plus importante chez deux cultivars résistants testés par rapport à deux cultivars sensibles.

Nos résultats ont révélé que parmi les DEG identifiés, quatre gènes PR-10 ont été trouvés (SORBI_3001G401300, SORBI_3001G401200, SORBI_3001G400800, SORBI_3001 G401000). Dans SC155-14E, les quatre PR-10 DEG ont été régulés à la hausse par le flg22 ou le traitement à la chitine, en revanche, dans BTx623, SORBI_3001G401000 n'a pas été trouvé dans les DEG et SORBI{{15} }G401300 (régulé à la hausse) n'a été présenté que dans BTx623 avec un traitement à la chitine mais pas avec un traitement à la flg22. Cela a indiqué que l'expression des gènes PR pouvait être utilisée en réponse à des niveaux de produits ROS plus élevés après le traitement par les MAMP et la résistance à l'anthracnose chez SC155-14E.

L'acide salicylique (SA) est un signal immunitaire végétal essentiel à la fois à la réponse de défense locale et à la résistance systémique acquise. Il joue un rôle important dans la résistance et la défense des plantes contre les attaques de pathogènes [55]. Dans le sorgho, Tugizimana et al. [56] ont rapporté des changements quantitatifs dans les niveaux d'acide jasmonique, de conjugués d'acide salicylique et d'acide abscissique dans le sorgho infecté par C. subline-ola. C. subline-ola est l'agent causal de l'anthracnose. Les génotypes de sorgho avec des niveaux accrus d'acides aminés (tryptophane et tyrosine), d'acide jasmonique et de conjugués salicyliques, et de zéatine étaient plus résistants à l'anthracnose. Dans cette étude, le terme GO «réponse à l'acide salicylique» (GO: 0009751) comprenant 19 DEG régulés à la hausse était spécifiquement enrichi uniquement en SC 155-14 E traité avec de la chitine (tableau S9). Par conséquent, la voie de signalisation salicylique pourrait jouer un rôle important en réponse à des niveaux de production de ROS plus élevés après le traitement au MAMP et à la résistance à l'anthracnose chez SC155-14E.

De plus, 169 DEG régulés positivement ont été enrichis en réponse à terme GO au stress uniquement dans SC 155-14 E traité avec de la chitine (tableau S9). Les autres termes GO trouvés uniquement dans SC155-14E traité avec des MAMP, mais pas dans BTx623 avec le même traitement sont les processus métaboliques secondaires (GO : 0019748), le processus de biosynthèse de la phosphatidylcholine (GO : 0006656) et le processus de biosynthèse des lipides ( ALLER : 0008610).

De plus, 169 DEG régulés positivement ont été enrichis en réponse à terme GO au stress uniquement dans SC 155-14 E traité avec de la chitine (tableau S9). Les autres termes GO trouvés uniquement dans SC155-14E traité avec des MAMP, mais pas dans BTx623 avec le même traitement sont les processus métaboliques secondaires (GO : 0019748), le processus de biosynthèse de la phosphatidylcholine (GO : 0006656) et le processus de biosynthèse des lipides ( ALLER : 0008610).

Nous avons également examiné la composition des gènes qui sont co-régulés entre les deux génotypes après traitement flg22 ou chitine ainsi que les ensembles de base de DEG dans tous les traitements et deux génotypes par analyse d'enrichissement GO (figures 4B et 7B). La liste complète des DEG est fournie dans les tableaux S14 et S15. La figure 4B montre les termes GO enrichis des ensembles de base des DEG totaux, régulés à la hausse et à la baisse dans BTx623 et SC155-14E avec tous les traitements. Les termes GO liés à la réponse des MAMP et à la défense des plantes (par exemple, la liaison de la chitine, la réponse de défense, l'activité de la protéine kinase, la phosphorylation des protéines, l'activité de la protéine sérine / thréonine kinase) ont été significativement enrichis en DEG régulés à la hausse, tandis que les termes GO du processus de biosynthèse des métabolites secondaires, la liaison des ions fer, l'activité oxydoréductase n'étaient enrichies qu'en DEG régulés à la baisse. Ce résultat était similaire aux résultats chez Arabidopsis où les termes GO liés à la réponse aux éliciteurs (peptides flg22 de P. simile WCS417 et P. aeruginosa PAO1, chitine et cellules bactériennes de P. simile WCS417) étaient le plus significativement enrichis dans le régulé à la hausse. ensemble de base de DEG [49].

La figure 7B a montré les termes GO significativement enrichis des ensembles de DEG co-régulés (c'est-à-dire régulés à la hausse ou à la baisse dans les deux génotypes) entre BTx623 et SC155-14E après un traitement par flg22 ou chitine. Les résultats ont révélé que les termes GO liés à la réponse des MAMP et à la défense des plantes (par exemple, la réponse de défense, l'activité de la protéine kinase, la phosphorylation des protéines, l'activité de la protéine sérine/thréonine kinase) n'étaient enrichis qu'en flg22 ou en DEG régulés à la hausse par la chitine dans les deux génotypes tandis que les termes GO du processus de biosynthèse des métabolites secondaires, la liaison de l'hème, la liaison des ions de fer, l'activité oxydoréductase d'un atome d'oxygène et le processus de biosynthèse de la phosphatidylcholine ont été enrichis uniquement dans des ensembles de DEG régulés à la baisse.

2.4. Analyse d'enrichissement de la voie KEGG de la réponse MTI de BTx623 et SC155-14E

La figure 9 montre l'analyse d'enrichissement de la voie KEGG des DEG régulés à la hausse trouvés dans les échantillons BTx623 et SC155-14E traités au MAMP à l'aide de l'outil en ligne DAVID [57]. La liste complète des DEG est fournie dans les tableaux S16 à S20. Les résultats identifient les voies KEGG supérieures spécifiques enrichies à la suite de l'activation de MTI dans les deux génotypes de sorgho. Dans la voie KEGG "interaction plante-pathogène", nous avons observé que 24 DEG régulés positivement étaient enrichis dans les échantillons de SC155-14E traités à la chitine, alors qu'aucun des DEG n'était enrichi dans les échantillons de BTx623 traités à la chitine. La réponse plus forte de la chitine du génotype SC 155-14 E est corrélée à la plus grande résistance de ce génotype à la maladie fongique anthracnose [39]. De plus, l'enrichissement de la voie KEGG a révélé 28 gènes impliqués dans la biosynthèse des phénylpropanoïdes à terme dans SC 155-14 E traité avec flg22. La voie de biosynthèse des phénylpropanoïdes commence par la phénylalanine qui peut être convertie en composés aromatiques tels que les flavonoïdes, les benzénoïdes, la coumarine, les hydroxycinnamates et la lignine [58,59]. De nombreux phénylpropanoïdes et flavonoïdes étaient impliqués dans la réponse de résistance à la maladie [28, 60]. La production de phytoalexines est une réponse de défense majeure contre l'agent pathogène de l'anthracnose C. subline-ola [28] dans le sorgho. Les 3- désoxy anthocyanidines sont un groupe inhabituel de flavonoïdes reconnus comme phytoalexines dans le sorgho. Les phytoalexines sont de petites molécules à activité antimicrobienne produites après une infection pathogène [61]. Wang et al. [37] ont également découvert que la biosynthèse des phénylpropanoïdes à terme KEGG était significativement enrichie en DEG de plantes infectées par C. subline-ola dans leur étude transcriptomique du sorgho. Il convient de noter que les résultats d'enrichissement de la voie KEGG (Figure 9) ont également montré une réponse plus élevée de BTx623 après le traitement des MAMP dans certaines voies qui pourraient jouer un rôle dans les interactions plante-pathogène (par exemple, dans les voies de biosynthèse de la phénylalanine et du tryptophane, la biosynthèse des antibiotiques).

En outre, les résultats de l'analyse de l'enrichissement de la voie KEGG des DEG régulés négativement ont révélé que dix DEG régulés négativement étaient annotés comme `` protéines d'antenne de photosynthèse '' et 84 DEG ont été annotés comme participant à la `` biosynthèse des métabolites secondaires '' ont été enrichis en flg22 traité BTx623. Cependant, de telles études d'expression génique peuvent identifier des gènes exprimés de manière différentielle en réponse à un traitement par les MAMP ou à une infection par un pathogène, mais cela ne démontre pas nécessairement que ces gènes sont essentiels à la résistance à un pathogène spécifique. Ainsi, des recherches supplémentaires seraient nécessaires pour comprendre les relations causales entre la résistance fongique et l'activation de ces voies KEGG dans les deux génotypes, comme l'a révélé l'analyse RNA-Seq.

Nous avons également effectué une analyse d'enrichissement de la voie KEGG pour les ensembles de base de DEG dans toutes les conditions (figure 4C) ainsi que les DEG co-régulés entre les deux génotypes après traitement flg22 ou chitine (figure 7C). Les résultats ont révélé que six voies importantes, y compris la voie d'interaction plante-pathogène, n'étaient enrichies que dans des ensembles de base de DEG régulés à la hausse, mais pas dans des ensembles de base de DEG régulés à la baisse. De même, sept et trois voies, y compris la voie d'interaction plante-pathogène, étaient significativement enrichies en DEG régulés à la hausse par la chitine et en DEG régulés à la hausse par flg22 dans BTx623 et SC155-14E, respectivement. En revanche, seule la biogenèse des ribosomes dans la voie des eucaryotes était enrichie en DEG régulés à la baisse par la chitine dans les deux génotypes.

2.5. Validation des données RNA-Seq à l'aide de la RT-PCR quantitative de gènes sélectionnés

Pour confirmer les données de profilage de l'expression génique obtenues par RNA-seq, nous avons effectué une analyse qRT-PCR pour évaluer l'expression de neuf gènes candidats sélectionnés. Ces neuf gènes ont été sélectionnés sur la base de l'expression observée par RNA-seq dans trois catégories : (a) exprimés de manière similaire dans BTx623 et SC155-14E avec flg22 ou traitement à la chitine ; (b) exprimé uniquement dans les MAMP traités SC155-14E mais avec une expression extrêmement faible dans le BTx623 traité et (c) exprimé 2 à 21- fois plus élevé dans les MAMP traités SC155-14E par rapport au BTx623 . Les résultats de l'analyse qRT-PCR (tableau 1) ont révélé un accord complet avec les niveaux d'expression déterminés par analyse ARN-seq pour chacun des neuf gènes évalués. Ces résultats nous donnent confiance que les mesures effectuées par RNA-seq reflètent la réponse transcriptionnelle des lignées de sorgho au traitement MAMP

2.6. conclusion

Dans cette étude, nous avons d'abord trouvé les conditions optimales de comparaison de la réponse MTI des deux génotypes en testant la production de ROS à l'aide de trois ensembles de feuilles et avons choisi les deuxièmes plus jeunes feuilles de plantes âgées de quinze jours pour l'extraction d'ARN et l'analyse transcriptomique ultérieure. Une évolution temporelle de la production de ROS déclenchée par flg22-et déclenchée par la chitine dans la lignée de sorgho SC155-14E (Figure 1C) a révélé que la production de ROS déclenchée par la chitine s'est produite plus tôt que celle déclenchée par le traitement flg22. Nous avons obtenu les profils d'expression du génotype SC155-14E du sorgho bicolore résistant à l'anthracnose avec une réponse élevée au traitement par les MAMP sur la production de ROS et le génotype sensible BTx623 avec une faible réponse du produit ROS au traitement par le MAMP au cours des premiers stades. de la réponse immunitaire innée.

Les résultats démontrent une nette variation de l'expression génique dans les génotypes de sorgho BTx623 et SC155-14E en réponse au traitement MAMP. Bien que les réponses aux deux MAMP aient montré un chevauchement considérable au sein de chaque ligne (86.6–70.8 pour cent), elles étaient distinctes. Un certain chevauchement, bien que plus faible (68,3 à 29 %) a également été observé entre les réponses des deux lignées au même MAMP. Un nombre considérable de DEG, 2272 sur 10 535 DEG, ont été identifiés dans les quatre conditions et définissent provisoirement la réponse MAMP de base. Cette liste de gènes devrait être utile aux laboratoires qui souhaitent établir le profil de la réponse d'expression génique au traitement MAMP. L'analyse ARN-seq a identifié de grands ensembles de gènes exprimés de manière différentielle dans BTx623 et SC155-14E traités avec flg22 ou chitine par rapport aux contrôles fictifs non traités de ces deux lignées. De plus, une comparaison des DEG sélectionnés à l'aide de deux pipelines bioinformatiques différents a montré des résultats très similaires. L'analyse détaillée du profil d'expression de ces DEG, l'analyse de l'enrichissement GO et l'analyse de la voie KEGG ont révélé une nette variation dans la réponse d'expression génique des deux génotypes. Le terme GO et l'enrichissement de la voie KEGG ont découvert plus de DEG liés à l'immunité et à la résistance aux agents pathogènes (gènes PR, réponse génique à la chitine, réponse génique à l'acide salicylique, réponse au stress, biosynthèse des phénylpropanoïdes, etc.) dans le SC traité au MAMP{{18} } E échantillons par rapport à BTx623 avec le même traitement. Ces informations fournissent des informations de base importantes sur la façon dont le système immunitaire inné de cette plante cultivée clé répond à l'élicitation des MAMP. Compte tenu du manque général d'informations sur la réponse immunitaire innée des plantes cultivées, par rapport au modèle Arabidopsis, les listes de gènes et les méthodes décrites fournissent une ressource pour une exploration plus approfondie de la réponse du sorgho aux agents pathogènes et devraient faciliter les efforts visant à améliorer la résistance aux maladies dans cette importante culture vivrière et de biomasse.

3. Matériels et méthodes

3.1. Matières végétales

Deux lignées de sorgho fournies par le Dr William Rooney (Texas A&M University, College Station, USA) et le Dr Stephen Kresovich (Clemson University, Clemson, USA) ont été utilisées dans cette étude. BTx623 est une lignée standard de sorgho avec une séquence du génome entier disponible [22], et SC155-14E est une lignée développée pour la résistance à l'anthracnose [39].

3.2. Dosages ROS

Les graines de sorgho de BTx623 et SC155-14E ont été stérilisées en surface (70 % d'éthanol pendant 1 min, puis 10 % d'eau de Javel pendant 10 min, rincées avec du ddH2O autoclavé) et plantées dans un mélange d'empotage Sunshine autoclavé, et ont germé dans des chambres de croissance ( 16 h/8 h lumière/obscurité, 28/26 ◦C, 60–70 % d'humidité). Des plantes âgées de quinze jours ont été utilisées pour des expériences.

Deux MAMP, flg22 (Genscript catalogue # RP19986) et la chitine de carapace de crabe (Sigma-Aldrich, catalogue # C3641), ont été utilisés dans cette étude. Flg22 est un peptide dérivé de l'extrémité N-terminale de la flagelline des bactéries phytopathogènes et est bien connu pour provoquer une réponse immunitaire innée spécifique chez les plantes [62]. La chitine est une molécule MAMP typique dérivée des parois cellulaires fongiques, qui provoque des réponses immunitaires chez les plantes [3]. Les dosages ROS ont été effectués selon Kimball et al. [38]. Pour évaluer la variation de la réponse MAMP au sein des génotypes individuels, ainsi que la position des feuilles, les trois feuilles entièrement développées des plantes de chaque génotype ont été évaluées individuellement. Les feuilles du bas vers le haut des plantes de sorgho âgées de quinze jours de chaque génotype ont été marquées comme feuille #1, #2 et #3. Nous n'avons utilisé que la partie médiane de la feuille pour l'échantillonnage afin de mesurer la production de ROS. Immédiatement après les traitements, le signal chimiluminescent de chaque échantillon a été enregistré pendant 30 minutes à l'aide d'une caméra Photek CCD (Photek Ltd., East Sussex UK). Huit puits consistaient en un traitement fictif (sans MAMP) et huit puits consistaient en un traitement (avec MAMP). Dans chaque cas, trois répétitions biologiques avec un total de 8 échantillons ont été comparées pour chaque traitement.

3.3. Exemple de traitement avec les MAMP

Des plantes âgées de quinze jours ont été utilisées pour des expériences. Les traitements MAMPs ont été réalisés comme décrit dans Valdes-Lopez et al. [12] avec des modifications mineures. En bref, la deuxième feuille (à partir du haut, c'est-à-dire la deuxième feuille la plus jeune) de cinq plantes pour chaque lignée de sorgho a été détachée puis infiltrée sous vide avec du ddH2O autoclavé pendant 2 min. Environ cinquante disques foliaires de 1 cm de diamètre ont été découpés à partir des feuilles infiltrées d'eau de chaque génotype et regroupés. Quarante-cinq disques de feuilles de chaque génotype ont été transférés dans trois boîtes de Pétri différentes (15 disques de feuilles dans chaque boîte de Pétri), puis ont flotté pendant une nuit à température ambiante sur ddH2O autoclavé avec les plaques recouvertes de papier d'aluminium. Le lendemain, l'eau a été retirée de toutes les boîtes de Pétri et remplacée par 10 ml de ddH2O (simulacre), 10 ml de flg22 1 µM ou 10 ml de solution de chitine à 20 mg/ml. Après un traitement de 60- minutes, des tranches de feuilles traitées par simulation et MAMP ont été récoltées dans différents tubes et immédiatement congelées dans de l'azote liquide. Les échantillons de tranches de feuilles (pour 101 séquences "ies ied-11272) immunitéBTx623 et SC155-14E avec traitements factices, flg22 ou chitine, trois réplicats biologiques) ont été stockés à -80 ◦C pour l'extraction de l'ARN. Tous les procédures décrites ci-dessus ont été réalisées dans des conditions sombres pour éliminer tout effet de photosynthèse possible.

3.4. Extraction d'ARN, séquençage et construction de bibliothèques

L'extraction de l'ARN a été réalisée à l'aide du kit Direct-zol RNA Miniprep Plus de Zymoresearch (catalogue #R2071) selon les instructions du fabricant.

Le séquençage à haut débit a été réalisé à l'Université du Missouri DNA Core Facility. Dix-huit bibliothèques ont été construites selon le protocole du fabricant avec des réactifs fournis dans le kit de préparation d'échantillons brins d'ARNm TruSeq d'Illumina. La concentration de l'échantillon a été déterminée par le fluorimètre Qubit (Invitrogen) à l'aide du kit de dosage d'ARN Qubit HS, et l'intégrité de l'ARN a été vérifiée à l'aide du système d'électrophorèse automatisé Fragment Analyzer. En bref, l'ARNm contenant du poly-A a été purifié à partir d'ARN total (1 ug), l'ARN a été fragmenté, l'ADNc double brin a été généré à partir d'ARN fragmenté et l'index contenant des adaptateurs a été ligaturé aux extrémités. Les constructions d'ADNc amplifiées ont été purifiées par l'ajout de billes de nettoyage Axyprep Mag PCR. La construction finale de chaque bibliothèque purifiée a été évaluée à l'aide du système d'électrophorèse automatisé Fragment Analyzer, quantifiée avec le fluoromètre Qubit à l'aide du kit de test d'ADNdb Qubit HS et diluée selon le protocole de séquençage standard d'Illumina pour le séquençage sur le NextSeq 500. La longueur de séquençage était unique lire à 75 bases.

3.5. Cartographie et traitement des lectures RNA-Seq

Les données de séquence représentaient six conditions différentes : BTx623 avec traitement factice, flg22 ou chitine, et SC155-14E avec traitement factice, flg22 ou chitine. Chaque condition était représentée par trois répétitions biologiques, résultant en 18 échantillons au total. Tout d'abord, les extrémités 30 des lectures ont été "coupées" pour les adaptateurs Illumina, pour les nucléotides ambigus (N) et (grâce à la technologie NextSeq) pour le poly-G artificiel (représenté par G{100}) à l'aide de cutadapt version 1.15 (http://dx.doi.org/10.14806/ej.17.1.200, consulté le 21 août 2019) pour les lectures dont les 30 extrémités chevauchent l'adaptateur pour un minimum de 3 bases avec 90 % d'identité. Si après ce découpage, une lecture contenait moins de dix bases, elle était rejetée (avec sa lecture appariée, le cas échéant). Les scores de qualité des données de séquençage de l'ARN après le découpage ont été examinés à l'aide de FASTQC (version 0.11.9) [63]. Pour toutes les positions en lecture, le score de qualité médian est d'environ 34, ce qui indique que la précision de l'appel de base est supérieure à 99,9 %. Les lectures pour chaque échantillon ont été alignées sur le génome de référence (Sorghum_bicolor_NCBIv3.dna. top-level. fa) avec Tophat 2.1.1. Les fichiers d'alignement résultants ont été fournis à Cufflinks 2.2.1 pour assembler les transcriptions de chaque échantillon. La version d'annotation utilisée dans cette recherche était Sorghum_bicolor_NCBIv3.38.gff3. Les échantillons de la même condition ont été fusionnés à l'aide de Cuffmerge. Le but était de fournir une base uniforme pour le calcul de l'expression des gènes et des transcrits dans chaque condition.

3.6. Analyse bioinformatique des données RNA-Seq

Les données de séquence d'ARN ont été analysées à l'aide des outils bioinformatiques Bowtie{{0}}.3.4.3, TopHat 2.1.1 et Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) avec des paramètres par défaut. Nous avons utilisé le même pipeline avec ces outils comme décrit dans Trapnell et al. [64]. Pour confirmer davantage les résultats du test, nous avons utilisé un autre pipeline avec HiSat2 (version 2.1.0), HTSeq (version 0.12.4) et edgeR (version 3.26.8) pour effectuer l'analyse. HiSat2 est le prochain développement de TopHat2. Tout d'abord, nous avons utilisé HiSat2 pour effectuer l'alignement à l'aide du génome de référence du sorgho. Ensuite, nous avons utilisé HTSeq pour compter le nombre de lectures mappées sur chaque gène. Pour cela, nous avions besoin des fichiers bam générés à l'étape précédente et de l'annotation du génome (fichier gif). Notez que le génome de référence et les fichiers d'annotation sont les mêmes que ceux que nous avons utilisés dans le pipeline d'origine. Enfin, nous avons utilisé le package R edgeR pour déterminer les gènes différentiellement exprimés dans chaque condition

3.7. Identification des gènes différentiellement exprimés
L'assemblage fusionné a été transmis à Cuffdiff, qui calcule les niveaux d'expression et teste la signification statistique des changements observés entre deux conditions. Nous avons comparé les conditions entre le mock et le flg22, et le mock et la chitine pour BTx623 et SC155-14E, respectivement. Les gènes différentiellement exprimés ont été extraits à l'aide de 0.001 seuils de valeur p. Les parcelles de volcan ont été réalisées à l'aide du package R (ggplot2 V3.3.0) pour montrer l'importance du changement d'expression génique dans les conditions BTx623 traité avec flg22 ou chitine et SC155- 14E traité avec flg22 ou chitine, respectivement. Les points de gène avec -log10 (valeur de p) égal ou supérieur à trois ont été considérés comme DEG. Dans chaque parcelle, les points de gène avec log2 (fold_changement) supérieur à zéro étaient des gènes régulés à la hausse, sinon, ils ont régulé à la baisse.

3.8. Parcelle PCA

Pour examiner la relation entre les valeurs d'expression génique de trois réplicats biologiques de chaque lignée de sorgho et chaque traitement MAMP, des parcelles d'analyse en composantes principales (PCA) ont été générées à l'aide de packages R (ggfortify V{{0}}.4.10, ggplot2 V3 .3.0). Chaque point représente une condition après la cartographie de l'espace de caractéristiques d'origine (expression génique) aux deux premiers composants principaux. Les points appartenant à la même condition ont tendance à se regrouper

3.9. Carte thermique des DEG

1 Division des sciences et technologies végétales et de la biochimie, CS Bond Life Sciences Center, Université du Missouri, Columbia, MO 65211, États-Unis ; cuiy@missouri.edu (YC); chendq@cau.edu.cn (DC)

2 Département de génie électrique et d'informatique, CS Bond Life Sciences Center, Université du Missouri, Columbia, MO 65211, États-Unis ; yjm85@mail.missouri.edu (YJ); xudong@missouri.edu (DX)

3 Department of Entomology and Plant Pathology, NC State University, Raleigh, NC 27695, USA; pjbalint@ncsu.edu

4 Plant Science Research Unit, USDA-ARS, Raleigh, NC 27695, États-Unis

* Correspondence: staceyg@missouri.edu