Qu’est-ce qui stimule la nouvelle croissance osseuse ? Cistanche (CPhGs) active la voie SIRT2-C/EBP-AREG pour construire des os plus solides

Résultats

 

2.1 Les CPhG atténuent l’ostéoporose induite par l’ovariectomie chez la souris

Les résultats de la micro-CT (Figure 1A) ont montré que, par rapport au groupe Sham, le groupe OVX présentait une destruction sévère de la microarchitecture osseuse trabéculaire dans le fémur distal, caractérisée par des trabécules clairsemées et fracturées. Dans le groupe OVX + CPhGs, le nombre trabéculaire et la connectivité ont été significativement restaurés, se rapprochant du niveau Sham. Ces résultats indiquent que les CPhG peuvent atténuer la perte osseuse induite par l'ovariectomie. La coloration HE (Figure 1B) a en outre confirmé que le nombre de trabécules était réduit dans le groupe OVX par rapport au groupe Sham, les trabécules résiduelles devenant plus fines et fracturées ; en revanche, le groupe OVX + CPhGs a présenté un nombre trabéculaire accru par rapport à OVX et une intégrité structurelle nettement améliorée. Le double marquage à la calcéine (Figure 1C) a démontré des bandes fluorescentes floues et étroitement espacées dans le groupe OVX, suggérant une formation osseuse inhibée ; dans le groupe OVX + CPhG, les bandes fluorescentes étaient claires avec un espacement significativement accru, indiquant que les CPhG favorisent le taux de minéralisation de la matrice osseuse et améliorent nettement la capacité de formation de nouveaux os.

 

 

Une image représentative de tomodensitométrie par micro-ordinateur de l'os trabéculaire dans la métaphyse fémorale de souris ; coloration à l'hématoxyline et à l'éosine des sections fémorales de souris ; Images de double marquage à la calcéine C de souris des groupes OVX et OVX+CPhGs.

Fig.1 Les CPhG atténuent l'ostéoporose induite par l'ovariectomie chez la souris

 

Autres avantages

 

 

 

 

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2.2 Effets des CPhG sur la différenciation ostéogénique des cellules MC3T3-E1

In vitro, le groupe CPhG a montré des niveaux d'expression de protéines et d'ARNm significativement plus élevés d'OCN, OPN et RUNX2 que le groupe NC (P <0,05). L'activité de la phosphatase alcaline (ALP) au jour 10 était également significativement plus élevée dans le groupe CPhG que dans le groupe NC (P < 0,05). Ces résultats indiquent que les CPhG favorisent de manière significative la différenciation des ostéoblastes. Voir le tableau 1.

 

2.3 Effets des CPhG sur l’axe SIRT2 – C/EBP –AREG

Les expériences cellulaires (Tableau 2) ont montré que, par rapport au groupe NC, le groupe CPhG présentait une expression significativement accrue des protéines et de l'ARNm de C/EBP et une augmentation de l'ARNm AREG (P < 0,05), indiquant l'activation des gènes cibles C/EBP en aval. Par rapport au NC, l’ARNm de SIRT2 était significativement régulé positivement dans le groupe CPhG (P < 0,05), avec une augmentation concomitante au niveau protéique (P < 0,05). En revanche, les niveaux d'ARNm de SIRT1, SIRT3, SIRT4 et SIRT5 n'ont montré aucun changement significatif (P > 0,05), confirmant la spécificité de la voie pour SIRT2.

Tableau 1. Les CPhG améliorent les marqueurs de différenciation ostéogénique dans les cellules MC3T3-E1

Article	Groupe NC	Groupe CPhG
protéine OCN	0.48 ± 0.14	1.24 ± 0.18¹
OCNARNm	1.00 ± 0.11	1.61 ± 0.23¹
protéine OPN	0.51 ± 0.15	1.05 ± 0.44¹
OPNARNm	1.03 ± 0.12	2.11 ± 0.24¹
Protéine RUNX2	0.77 ± 0.21	1.08 ± 0.25¹
RUNX2ARNm	1.02 ± 0.14	1.58 ± 0.17¹
Activité ALP au jour 10	0.21 ± 0.02	0.44 ± 0.05¹

¹ P< 0,05 par rapport au groupe NC.

 

Tableau 2. Effets des CPhG sur l'expression de SIRT2, C/EBP et AREG

Article	Groupe NC	Groupe CPhG
Protéine C/EBP	0.51 ± 0.06	1.21 ± 0.11¹
C/EBPARNm	1.00 ± 0.10	1.15 ± 0.14¹
AREGARNm	1.01 ± 0.15	2.05 ± 0.24¹
SIRT1ARNm	1.03 ± 0.12	1.01 ± 0.11
Protéine SIRT2	0.26 ± 0.08	0.37 ± 0.07¹
SIRT2ARNm	0.87 ± 0.08	1.88 ± 0.21¹
SIRT3ARNm	1.01 ± 0.14	1.28 ± 0.17
SIRT4ARNm	1.21 ± 0.12	1.04 ± 0.05
SIRT5ARNm	1.06 ± 0.05	1.08 ± 0.03

¹ P< 0,05 par rapport au groupe NC.

 

2.4 Effets et mécanisme des CPhG sur SIRT2 et C/EBP

L'immunofluorescence (Figure 2A) a révélé une expression nettement améliorée et une co-localisation nucléaire de SIRT2 et C/EBP dans le groupe CPhG par rapport à NC. Alors que les signaux SIRT2 et C/EBP étaient faibles en NC, leurs intensités de fluorescence étaient significativement augmentées par les CPhG, avec des signaux clairs de colocalisation nucléaire, suggérant une interaction renforcée. La co-immunoprécipitation a en outre confirmé que, dans les complexes pull-down C/EBP, la protéine SIRT2 était significativement augmentée dans le groupe CPhG par rapport à NC (Figure 2B). Dans les immunoprécipités C/EBP, le signal acétyl-lysine (acétyl) a diminué dans le groupe CPhG, alors que la protéine C/EBP totale était inchangée (Figure 2C), ce qui indique que les CPhG améliorent de manière significative l'interaction SIRT2 – C/EBP et suppriment l'acétylation endogène C/EBP dans les cellules MC3T3-E1.

2.5 Effets de SIRT2 sur l'expression de la protéine C/EBP et de l'ARNm

Par rapport au groupe témoin, l’inactivation de SIRT2 (SIRT2 KD) a réduit de manière significative les niveaux de protéine C/EBP et d’ARNm dans les cellules MC3T3-E1. Par rapport aux contrôles + CPhG, le groupe SIRT2 KD + CPhGs a également présenté une diminution de la protéine C/EBP et de l'ARNm, et les CPhG n'ont pas pu inverser la réduction provoquée par l'inactivation de SIRT2 (Figures 3A, 3B). Ces résultats indiquent que la perte de SIRT2 diminue nettement l’accumulation de protéine C/EBP et l’expression de l’ARNm de C/EBP.

A, analyse d'immunofluorescence de SIRT2 (rouge) et C/EBP (vert) dans des cellules MC3T3-E1 traitées par CPhGs (× 200) ; B, analyse de co-immunoprécipitation (co-IP) de l'interaction SIRT2-C/EBP ;

Fig.2 Effet des CPhG sur SIRT2 et C/EBP et son mécanisme

 

2.6 Effets de la désacétylation du C/EBP sur la différenciation ostéogénique

Des mutants du site d'acétylation C/EBP (K102R et K211R) ont été construits pour imiter une désacétylation soutenue. Nous avons évalué l'activité ALP au stade précoce de différenciation (jour 7) et la minéralisation au stade terminal (jour 14). Par rapport au WT, les mutants K102R et K211R présentaient une zone ALP-positive accrue, et la coloration à l'Alizarin Red S (ARS) montrait une minéralisation accrue de la matrice extracellulaire. Cependant, le groupe EX a présenté des augmentations plus importantes d'ALP et d'ARS que n'importe quel mutant unique, ce qui suggère que les CPhG modulent de manière coopérative les sites K102 et K211 pour favoriser de manière globale la formation osseuse (Figure 3C). Ces résultats indiquent que l'effet pro-ostéogénique des CPhG est associé à une différenciation précoce et à une minéralisation terminale médiée par la désacétylation de C/EBP, fournissant la preuve fonctionnelle que les CPhG influencent la différenciation ostéogénique via l'axe SIRT2/CEBP/AREG.

Discussion

 

L'ostéoporose est devenue un problème de santé publique mondial qui affecte gravement la qualité de vie des patients. Les médecines traditionnelles chinoises telles que le Cistanche (Rou Cong Rong), le Ligustrum lucidum et la Morinda officinalis jouent un rôle important dans la gestion de l'ostéoporose et attirent de plus en plus l'attention en raison de la diminution des effets indésirables et de leur efficacité stable [8-9]. Le cistanche et ses constituants peuvent moduler la formation et la résorption osseuses et présentent un fort potentiel pour la prévention et le traitement de l'ostéoporose. Une étude [10] a révélé que l'extrait de Cistanche favorise la différenciation des cellules souches mésenchymateuses vers les ostéoblastes, augmentant ainsi efficacement la masse osseuse tout en réduisant la résorption osseuse. Une autre étude [11] a montré que les polysaccharides de Cistanche inhibent l'ostéoclastogenèse et la résorption de l'hydroxyapatite, en partie en supprimant les gènes marqueurs des ostéoclastes (par exemple Ctsk, MMP9 et ACP5).

Cette étude a systématiquement étudié les effets et les mécanismes moléculaires des CPhG dans le traitement de l'ostéoporose. Grâce à des expériences in vivo et in vitro, nous avons constaté que les CPhG favorisent de manière significative la différenciation ostéogénique en modulant l'axe SIRT2 – C/EBP – AREG, fournissant ainsi une nouvelle base théorique pour réguler le métabolisme osseux avec des produits naturels.

Nous avons démontré que les CPhG améliorent le phénotype de perte osseuse chez les souris ovariectomisées en activant l'axe SIRT2 – C/EBP –AREG, augmentant ainsi de manière significative le nombre trabéculaire et favorisant la formation osseuse. Nos résultats montrent que les CPhG régulent nettement à la hausse les marqueurs ostéogéniques (OCN, OPN, RUNX2) et l'activité ALP. En tant que régulateur principal de la différenciation ostéogénique [12], la régulation positive de RUNX2 peut directement piloter la minéralisation de la matrice osseuse, et une activité accrue de l'ALP soutient en outre la maturation de la fonction des ostéoblastes. Nous révélons pour la première fois que les CPhG régulent positivement l'expression de SIRT2, renforcent son interaction avec C/EBP et induisent une désacétylation de C/EBP. Le C/EBP désacétylé subit probablement des changements de conformation qui améliorent l'activité transcriptionnelle et régulent significativement positivement l'ARNm d'AREG ; en tant que ligand de l'EGFR, AREG peut activer la voie PI3K – AKT pour favoriser l'ostéogenèse, conformément à ZHANG et al. [13], qui ont rapporté que l'extrait de Cistanche supprime la différenciation des ostéoclastes via PI3K/AKT. En utilisant des mutants du site d'acétylation de C/EBP (K102R et K211R), nous avons directement confirmé que la désacétylation de C/EBP favorise la calcification de la matrice extracellulaire, tandis que l'inactivation de SIRT2 a établi la nécessité de cette voie dans l'action du CPhG, indiquant que la désacétylation de C/EBP médiée par SIRT2 est au cœur des effets pro-ostéogéniques des CPhG. Ces résultats élargissent la diversité reconnue des fonctions de la famille Sirtuin dans l'homéostasie osseuse et suggèrent de nouvelles stratégies pour traiter l'ostéoporose en ciblant les modifications post-traductionnelles.

Les ostéoblastes jouent un rôle clé dans le processus complexe de remodelage osseux. Le déséquilibre entre la formation osseuse et la résorption, largement régulé par les ostéoblastes, est un facteur majeur de l'ostéoporose. L’amélioration de la formation osseuse constitue donc une stratégie thérapeutique fondamentale. Un remodelage efficace dépend d'interactions coordonnées entre les ostéoblastes et les ostéoclastes. AREG, membre de la famille EGF, joue un rôle essentiel dans la régulation de la croissance cellulaire, de l'apoptose et de la migration entre divers types de cellules [14]. SIRT2 est une désacétylase dépendante du NAD+-exprimée principalement dans le cytoplasme mais également présente dans les mitochondries et le noyau, ce qui en fait un membre unique de la famille Sirtuin (15). En tant que facteur de transcription, C/EBP subit une désacétylation sous régulation SIRT2, augmentant l'activité transcriptionnelle de divers gènes. Au cours de la différenciation des ostéoblastes, C/EBP se lie à plusieurs gènes pour moduler la transcription. Nos résultats montrent que les CPhG améliorent l'expression de la protéine C/EBP et son interaction avec SIRT2, suppriment nettement l'acétylation de C/EBP et, à leur tour, régulent positivement l'ARNm d'AREG, favorisant ainsi la différenciation ostéogénique. Bien que l'expression de C/EBP soit en corrélation positive avec la transcription AREG, la question de savoir si C/EBP sert directement de facteur de transcription AREG justifie une validation plus approfondie.

En résumé, les CPhG favorisent la désacétylation de C/EBP via SIRT2, augmentant ainsi l'expression d'AREG, améliorant la différenciation des ostéoblastes et améliorant l'ostéoporose. Les CPhG ont un potentiel en tant qu’agents thérapeutiques contre l’ostéoporose.

 

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Références

[10] Li Y, Pei T, Zhu H et al. La mélatonine atténue l'augmentation de la fréquence du pouls de l'hormone lutéinisante et le dysfonctionnement ovarien induits par la perturbation du rythme circadien.J Pinéale Rés.2025;77(1):e70026. est ce que je:10.1111/jpi.70026

[11] Liu J, Yang Y, He Y et al. La décoction d'Erxian atténue l'insuffisance ovarienne prématurée induite par le cisplatine chez le rat en réduisant les niveaux d'oxydation dans les cellules de la granulosa ovarienne.J Ethnopharmacol.2023;304:116046. est ce que je:10.1016/j.jep.2022.116046

[12] Yang ZN, Du X, Wang A et al. La mélatonine améliore l'homéostasie mitochondriale induite par le plomb et les lésions ovariennes en régulant la voie de signalisation p38.Ecotoxicol Environ Saf.2025;292:117937. est ce que je:10.1016/j.ecoenv.2025.117937

[13] Okoye CN, Koren SA, Wojtovich AP. Production du complexe mitochondrial I ROS et signalisation redox en hypoxie.Rédox Biol.2023;67:102926. est ce que je:10.1016/j.redox.2023.102926

[14] Keskin-Aktan A, Akbulut KG, Yazici-MutluÇ, et al. Les effets de la mélatonine et de la curcumine sur l'expression de SIRT2, Bcl-2 et Bax dans l'hippocampe de rats adultes.Cerveau Res Bull.2018;137 : 306-310. est ce que je:10.1016/j.brainresbull.2018.01.006

[15] Zhu T, Yan L, Deng S et al. Les mitochondries des ovocytes porcins synthétisent la mélatonine, ce qui améliore leur maturation in vitro et leur développement embryonnaire.Antioxydants.2024;13(7):814. est ce que je:10.3390/antiox13070814