Wnt1 exogène prévient les lésions rénales aiguës et leur progression ultérieure vers une maladie rénale chronique

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Xue Hong^1†, Yanni Zhou^2†, Dedong Wang^3†, Fuping Lyu⁴, Tianjun Guan³, Youhua Liu^1,5et Liangxiang Xiao^{3 *}

¹Laboratoire clé d’État de recherche sur les défaillances d’organes, Centre national de recherche clinique sur les maladies rénales, Division de néphrologie, Hôpital Nanfang, Université de médecine du Sud, Guangzhou, Chine,²Département de néphrologie, Xiamen Hôpital affilié à l’Université de médecine chinoise de Beijing, Xiamen, Chine,³Département de néphrologie, Zhongshan Hôpital affilié à l’Université de Xiamen, Xiamen, Chine,⁴Département d’endocrinologie et de diabète, le premier affilié Hôpital de l’Université de Xiamen, Xiamen, Chine,⁵Département de pathologie, École de médecine de l’Université de Pittsburgh, Pittsburgh, PA, États-Unis

Des études suggèrent que les agonistes de la Wnt/β-caténine sont bénéfiques dans le traitement desaigu lésion rénale(AKI); cependant, il reste insaisissable quant à son rôle dans la prévention de l’IRA et sa progression vers une maladie rénale chronique (IRC). Dans cette étude, Wnt/β-caténine rénale la signalisation était soit activée par une surexpression de Wnt1 exogène, soit inhibée par administration avec ICG-001, une petite molécule inhibitrice de la signalisation de la β-caténine, avant les souris ont été soumises à une lésion d’ischémie/reperfusion (IRI) pour induire une IRA et des lésions ultérieures CKD. Nos résultats ont montré que l’expression in vivo de Wnt1 exogène avant IR a protégé les souris contre l’IRA et a entravé la progression de l’IRA vers l’IRC chez la souris, comme mis en évidence par des analyses biochimiques sanguines et histologiques rénales. En revanche, le prétraitement de l’ICG-001 avant l’IR n’a eu aucun effet sur la signalisation rénale de la Wnt/β-caténine ou la progression de l’IRA vers l’IRC. Mécaniquement, expression in vivo de Wnt1 exogène avant que l’IR ne supprime l’expression des protéines proapoptotiques chez les souris IRA et réduise réponses inflammatoires chez les souris AKI et CKD. De plus, Wnt1 exogène apoptose inhibée des cellules tubulaires induite par le traitement par hypoxie-réoxygénation (H/R) in vitro. Pour conclure, la présente étude fournit des preuves à l’appui de la prévention effet de l’activation de la Wnt/β-caténine sur l’IRA liée à l’IR et sa progression ultérieure à CKD.

Mots-clés : lésion rénale aiguë, maladie rénale chronique, Wnt1, β-caténine, lésion d’ischémie-reperfusion

Le traitement delésion rénale aiguë(AKI): cistanche

INTRODUCTION

Lésion rénale aiguë (IRA)est une affection clinique due à une perte rapide de la fonction rénale par divers les blessures, comme les médicaments, l’ischémie, la septicémie et les toxines (Chawla et Kimmel, 2012; Scholz et coll., 2021). L’IRA est associée à une incidence élevée de morbidité et de mortalité, responsable d’environ 2 millions de décès chaque année dans le monde (Belayev et Palevsky, 2014). En particulier, l’IRA est un prédicteur indépendant bien reconnu du développement de l’insuffisance rénale chronique (IRC) ou de l’insuffisance rénale terminale (IRT), qui ont imposé un fardeau économique énorme au système de soins de santé (Leung et coll., 2013; Belayev et Palevsky, 2014; Kurzhagen et coll., 2020). Malheureusement, il n’existe pas de médicaments efficaces pour le prévention et traitement de l’IRA.

La signalisation Wnt/β-caténine joue un rôle fondamental dans organogenèse, homéostasie tissulaire et développement de diverses maladies, y compris les maladies rénales (Soni, 2021). β-Caténine a un double rôle en servant à la fois de structure et un régulateur de transcription (MacDonald et al., 2009). La β-caténine liée à la membrane fait partie des adhérences complexe de jonction et contribue à l’interaction cellule-cellule, alors que la β-caténine cytosolique est phosphorylée par le glycogène synthase kinase-3β (GSK-3β) et ciblée pour l’ubiquitination et la dégradation protéasomique. Cependant, une telle dégradation de β-caténine pourraient être sauvés par les ligands Wnt, une famille de glycoprotéines sécrétées ayant diverses activités biologiques. La liaison de Wnt stabilise β-caténine, qui se transloque dans le noyau et agit comme un facteur de transcription pour le gène réglementation. Notamment, la signalisation Wnt/β-caténine est relativement réduit au silence dans les reins adultes non blessés, mais réactivé pendant lésions rénales aiguës et chroniques (Huffstater et coll., 2020). L’activation de la Wnt/β-caténine au stade précoce de l’IRA réduit lésion rénale et favorise la récupération de la fonction rénale, alors qu’une activation soutenue de Wnt/β-caténine pourrait conduire à la progression de l’IRA à l’IRC (Xiao et coll., 2016; Huffstater et al., 2020). Par conséquent, la signalisation Wnt/β-caténine est à double tranchant. épée dans les lésions rénales et justifie une meilleure compréhension. Notamment, il reste insaisissable sur le rôle de Wnt / β-caténine activation dans la prévention de l’IRA et de ses conséquences Progression de l’IRA-IRC.

La lésion d’ischémie rénale-reperfusion (IRI) est considérée comme le cause majeure de l’IRA. Par conséquent, le modèle animal IRI rénal a a été couramment utilisé pour la recherche sur l’IRA et l’IRA-IRC progression (Bonventre et Yang, 2011). Les deux pharmacologiques et des approches génétiques ont été utilisées pour élucider le rôle de l’activation de la caténine Wnt/β dans les modèles IRI d’IRA et CKD, respectivement. Le lithium et les inhibiteurs de GSK-3β sont couramment utilisé pour activer pharmacologiquement Wnt/β-caténine signalisation dans les modèles AKI précliniques, mais il convient de noter sur leurs effets indépendants de la β caténine (Bao et coll., 2014). Modifications génétiques des ligands GSK-3β, β-caténine ou Wnt (Wnt1 et Wnt9a) ont été utilisés pour élucider le rôle de Activation de la caténine Wnt/β dans l’IRA et l’IRC (Bonventre et Yang, 2011; Bao et coll., 2014; Zhou et coll., 2013, 2018; Liu et coll., 2020). Néanmoins, des études sur le rôle de Wnt/β-caténine la signalisation dans la prévention de l’IRA est assez limitée. Le La présente étude visait à élucider le rôle de la signalisation Wnt/β-caténine dans la prévention de l’IRA et de ses conséquences progression vers l’IRC.

FIGURE 1 | L’expression in vivo de Wnt1 exogène avant IR prévient l’IRA et active la β-caténine rénale chez la souris

(A)Groupes de traitement de souris. Les souris ont été traitées avec soit pcDNA3 (IRI + pcDNA3) ou PHA-Wnt1 (IRI + PHA-Wnt1) plasmide par injection hydrodynamique de la veine caudale 2 jours avant BIRI. Taux sériques de créatinine(B)et taux d’azote uréique dans le sang (BUN)(C)ont été mesurés.(D)Micrographies représentatives de la morphologie rénale 1 jour après BIRI. Les coupes rénales ont été soumises à Coloration périodique acide-Schiff. Les zones encadrées sont agrandies. Les flèches indiquent des tubules rénaux. Barre d’échelle, 200 μm.(E, F)Analyse par transfert western de la β-caténine active dans les reins de souris. *P< 0.05="" versus="" sham="" controls="" (n="5)." †p="">< 0.05="" versus="" iri="" injected="" with="" pcdna3="" plasmid="" (n="">

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MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Étude animale

Les souris mâles C57BL/6 pesant environ 22 à 25 g étaient acheté de Vital River Laboratory Animal Technology (Beijing, Chine), et maintenu dans l’animalerie (température: 22 ± 2 ◦C, humidité: 60 ± 5%, 12h sombre / clair cycle) à la Southern Medical University (Guangzhou, Chine) avec eau et nourriture ad libitum. Les études sur les animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique et de bien-être des animaux de Southern Medical Université. Tous les animaux ont été traités conformément à la Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.

L’induction de l’IRA et de l’IRC chez la souris a été décrite dans nos études antérieures (Xiao et coll., 2016; Zhou et al., 2018). Ischémie rénale bilatérale/lésion de reperfusion (BIRI) a été largement utilisé pour induire l’IRA chez la souris, alors que il augmente la mortalité au cours de la progression de l’IRA à CKD. Par conséquent, ischémie rénale unilatérale / reperfusion la blessure (UIRI) est utilisée pour la recherche sur la progression de l’IRA à l’IRC. Brièvement, une incision abdominale médiane était fabriqué chez la souris sous anesthésie générale et bilatérale ou les pédicules rénaux gauches ont été coupés pendant 30 minutes à l’aide de pinces à microanévrisme (article n° 18051-35; Sciences fines Tools, Cambridge, Royaume-Uni). Pendant la chirurgie, le corps la température a été maintenue à environ 37–38◦C à l’aide d’un système de chauffage à température contrôlée.

Évaluer l’effet préventif de l’activation de la Wnt/β-caténine sur l’IRA, des souris ont reçu une injection de 1 mg/kg d’hémagglutinine Vecteur d’expression Wnt1 marqué (HA) (PHA-Wnt1, Upstate Biotechnologie) ou vecteur vide (aDNCp3) 2 jours avant BIRI utilisant la technique de transfert de gènes basée sur l’hydrodynamique comme rapporté précédemment (Xiao et al., 2016). Tissus sanguins et rénaux ont été prélevés 1 jour après le BIRI rénal.

Évaluer l’effet de l’activation précoce de Wnt/β-caténine sur la progression de l’IRA vers l’IRC, les souris ont été soumises à l’injection hydrodynamique quotidienne de la veine caudale de l’expression de Wnt1 plasmides à 1 mg/kg ou injection intrapéritonéale quotidienne d’ICG-001 (847591-62-2, Chembest, Shanghai, Chine) à 5 mg/kg pendant 3 jours avant uiri. Le sang et les tissus rénaux ont été prélevés 11 jours après UIRI. Dans notre étude préliminaire, 2 jours d’injection de Wnt1 pourrait induire l’expression de Wnt1 chez les souris AKI (données non montré). Il convient de noter que 3 jours d’injection de Wnt1 ont été choisi pour assurer et allonger l’expression de Wnt1 pendant le progression de l’IRA vers l’IRC.

La lésion rénale aiguë (IRA) est une affection clinique due à une perte rapide de la fonction rénale

Culture cellulaire et traitement

La lignée cellulaire épithéliale tubulaire proximale humaine (HKC-8) était fourni par le Dr L. Racusen à l’Université Johns Hopkins (Baltimore, MD, États-Unis). Les cultures cellulaires ont été réalisées en tant que décrit précédemment (Zhou et al., 2013). Les cellules HKC-8 ont été traitées avec Wnt1 recombinant humain (SRP4754; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis) à 100 ng/mL ou ICG-001 (847591- 62-2, Chembest, Shanghai, Chine) à 10 μM pendant 4 h. Les cellules étaient puis incubé dans un poste de travail d’hypoxie (X3-CK, Biospherix) à 1% pO2 pendant 48 h. Ensuite, les cellules ont été réoxygénées pendant 2 h avant collecte pour diverses analyses.

FIGURE 2 | L’expression in vivo de Wnt1 exogène avant IR réduit l’apoptose des cellules tubulaires et l’activation de NF-κB chez les souris AKI

(A)Les micrographies représentatives montrent Cellules TUNEL-positives dans différents groupes comme indiqué. Les flèches indiquent une coloration positive. Barre d’échelle, 100 μm.(B)La présentation graphique montre les cellules TUNEL-positives par champ de haute puissance (HPF) dans différents groupes comme indiqué.(C–F)Les analyses représentatives par transfert de Western montrent l’expression rénale de FasL, p53 et Bax dans différents groupes comme indiqué. *P< 0.05="" versus="" sham="" controls;="" †p="">< 0.05="" versus="" iri="" injected="" with="" pcdna="" plasmids="" (n="5–6).">(G)Transfert Western représentatif de p65 et Protéines p-p65 dans différents groupes comme indiqué.

Essai d’apoptose

Les cellules ont été trypsinisées, collectées et lavées avec du PBS. La coloration PE Annexin V a été effectuée conformément à la protocole du fabricant. Une analyse cytométrique a été effectuée avec un cytomètre en flux (BD FACSCanto II, San Jose, CA, États-Unis) pour mesurer les taux d’apoptose en détectant le quantité relative de PE Annexin V positif et de 7-AAD négatif Cellules. Chaque essai a été effectué en trois exemplaires.

Créatinine et azote uréique sanguin Test

Taux de créatinine dans le sérum et l’urine ainsi que dans l’urée dans le sang les niveaux d’azote (BUN) ont été mesurés à l’aide d’un système automatique analyseur biochimique (AU480, Beckman-Coulter Inc., Brea, CA, États-Unis).

Histologie et immunohistochimique Coloration

Les coupes rénales et la coloration immunohistochimique étaient effectuée comme décrit précédemment (Liu et coll., 2020). Les anticorps primaires comprenaient l’anti-Wnt1 polyclonal de lapin (ab15251; Abcam, Inc.), anti-β-caténine polyclonale de lapin (ab15180; Abcam, Inc.), et l’anti-fibronectine polyclonale de lapin (F3648; Sigma-Aldrich).

Analyse Western Blot

L’analyse par transfert Western a été effectuée comme décrit précédemment (Zhou et al., 2019). Anticorps primaires inclus lapin anti-fibronectine polyclonale (F3648; Sigma-Aldrich), souris anticorps monoclonal anti-β-caténine (610154; BD Transduction Laboratoires), anticorps monoclonal anti-α-SMA de souris (A2547; Sigma-Aldrich), lapin polyclonal anti-Wnt1 (ab15251; Abcam), souris anti-α-tubuline (T9026; Sigma-Aldrich), anticorps antiPAI-1 de souris (AF3828; Systèmes de R&D), β-caténine anti-active (#05–665; EMD Millipore), ligand anti-Fas (FasL) (SC -6237; Santa Cruz, CA, États-Unis), p53 (#2524S; CST), Bax (SC20067; Santa Cruz), p65 (#8242S; CST), p-p65 (#3033S; CST), PCNA (#2586S; CST).

Extraction d’ARN et analyse qPCR

L’isolement de l’ARN total et la qPCR ont été effectués comme précédemment décrit. Les niveaux d’ARNm de divers gènes ont été normalisés avec β-actine. Les séquences d’amorce des gènes sont énumérées dans Tableau supplémentaire 1.

FIGURE 3 | L’expression in vivo de Wnt1 exogène avant IR empêche la progression de l’IRA vers l’IRC chez la souris

(A)Groupes de traitement de souris. Les souris ont été soumises à soit injection hydrodynamique de veine caudale de 1 mg/kg d’ADNPi3 (IRI + aDNNP3) ou de plasmide PHA-Wnt1 (IRI + PHA-Wnt1), soit injection intrapéritonéale de 5 mg/kg d’ICG-001 à 3 jours avant UIRI. Le sang et les tissus ont été prélevés 11 jours après l’UIRI. Taux sériques de créatinine(B)et les taux d’azote uréique dans le sang (BUN)(C)ont été mesurés.(D)Micrographies représentatives de la morphologie rénale 11 jours après l’UIRI. Les coupes rénales ont été soumises à une coloration périodique acide-Schiff. Les zones en boîte sont agrandi. Les flèches indiquent des tubules rénaux. Barre d’échelle, 100 μm. *P< 0.05;="" **p="">< 0.01.="" n="">

Analyse statistique

Toutes les données ont été exprimées en moyenne ± SEM. Les données étaient les suivantes : analysé statistiquement à l’aide du logiciel Sigma Stat (Jandel Scientific Logiciel, San Rafael, CA, États-Unis). Comparaison entre les groupes a été fait en utilisant anova unidirectionnelle, suivi du test Student-Newman-Keuls. P< 0.05="" was="" considered="">

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RÉSULTATS

Expression in vivo de Wnt1 exogène Avant que l’IR ne prévienne les lésions rénales aiguës et active la β-caténine rénale chez la souris

Pour déterminer le rôle de l’activation de la caténine Wnt/β dans l’IRA prévention, les souris ont été administrées avec l’un ou l’autre ha-marqué Vecteur d’expression Wnt1 (PHA-Wnt1) ou vecteur vide (pcDNA3) par injection hydrodynamique de la veine caudale 2 jours avant le BIRI(Figure 1A). Les taux sériques de créatinine et de BUN, deux biomarqueurs de lésions rénales, ont été significativement augmentés chez la souris 1 jour après BIRI, suggérant l’existence d’une IRA (figures 1B, C). Systématiquement, des lésions morphologiques rénales proéminentes, telles que des lésions tubulaires dans la jonction corticomédullaire ont été observées chez les souris AKI(Figure 1D). Notamment, ces altérations du sérum biomarqueurs de lésions rénales et lésions morphologiques chez les souris IRA ont été nettement atténués par Wnt1 exogène. Western blot les analyses ont révélé que Wnt1 exogène favorisait l’expression de β-caténine rénale chez les souris IRA(Figures 1E, F). Pris ensemble, ces résultats suggèrent que le prétraitement de Wnt1 exogène active la β-caténine rénale et prévient l’IRA chez la souris.

Expression in vivo de Wnt1 exogène Avant que l’IR ne réduise les cellules tubulaires Apoptose et inhibe le nucléaire Activation du facteur Kappa B

Explorer si la régulation de l’apoptose est le mécanisme sous-jacent à l’effet protecteur de Wnt1 exogène sur l’IRA, La coloration TUNEL a été réalisée pour identifier l’apoptose dans le tissu rénal de souris AKI. Comparé aux souris Sham, IRI a nettement augmenté le taux d’apoptose ainsi que les niveaux de protéines liées à l’apoptose, telles que FasL, p53 et Bax, dans reins de souris(Figures 2A à F). De telles altérations dans les reins des souris AKI ont été nettement réduites par l’expression in vivo de Wnt1 exogène avant IR. Le facteur nucléaire kappa B (NFκB), en particulier sa forme hétérodimère p65/p50, joue un rôle critique rôle dans la régulation de la réponse inflammatoire dans les reins de Souris AKI. L’analyse par transfert western a montré que p65 et sa forme phosphorylée (p-p65) a été nettement augmentée en reins de souris après IRI, alors que de telles altérations étaient empêché par Wnt1 exogène(Figure 2G). Ces résultats suggèrent que l’expression in vivo de Wnt1 exogène avant L’IR prévient l’apoptose et inhibe l’activation de NF-κB dans reins de souris AKI.

FIGURE 4 | L’expression in vivo de Wnt1 exogène avant IR régule à la baisse Wnt1 endogène et β-caténine dans les reins de souris après progression de l’IRA-IRC

(A)Des micrographies représentatives montrent l’expression de la protéine Wnt et β-caténine dans différents groupes, comme indiqué. Barre d’échelle, 50 μm.(B–E)Représentant Western blot analyses des niveaux de Wnt1, de β-caténine et de protéines actives de β-caténine dans différents groupes, comme indiqué.(F)L’expression de l’ARNm du TGF-β dans différents groupes comme indiqué. *P< 0.05;="" **p="">< 0.01.="" n="">

Expression in vivo de Wnt1 exogène Avant que l’IR n’empêche la progression de Lésion rénale aiguë au rein chronique Maladie

Nous avons ensuite examiné si l’activation de Wnt/β-caténine avant que l’IR puisse empêcher la progression de l’IRA vers l’IRC. Comme illustré dansGraphique 3A, les souris ont subi soit une hydrodynamique injection veineuse de plasmide d’expression Wnt1 (PHA-Wnt1) ou injection intrapéritonéale d’ICG-001 à 3 jours avant uiri. Les taux sériques de créatinine et de BUN étaient augmentation chez la souris 11 jours après l’UIRI(Figures 3B, C). De plus, la coloration trichrome masson a révélé une importance importante dépôt de collagène rénal et lésions fibrotiques chez la souris à 11 jours après l’UIRI(Figure 3D). Ces observations indiquer la progression de l’IRA vers l’IRC chez la souris après UIRI. Notamment, les altérations observées du rein sérique les biomarqueurs de lésion et la fibrose rénale chez les souris atteints d’IRC étaient presque complètement évité par le prétraitement exogène Wnt1, mais pas ICG-001. Par conséquent, l’expression in vivo de Wnt1 exogène avant IR empêche la progression de AKI à CKD chez la souris.

Expression in vivo de Wnt1 exogène Avant que l’IR ne régule à la baisse endogène Wnt1 et β-caténine dans les reins

Nous avons étudié plus en détail l’effet de Wnt1 exogène sur signalisation endogène Wnt/β-caténine dans les reins de souris atteintes d’IRC. Comme le montre la figure 4A, une coloration immunohistochimique révélée que la Wnt1 endogène et la β-caténine étaient nettement régulées à la hausse dans les reins de souris 11 jours après l’IRI. Leur protéine ont été considérablement réduits par le prétraitement de l’exogène Wnt1, mais pas ICG-001. Les analyses par transfert western ont confirmé le effet inhibiteur de Wnt1 exogène, mais pas d’ICG-001, sur expression endogène de Wnt1, β-caténine et β-caténine active dans les reins de souris atteintes d’IRC (figures 4B à E). La caténine Wnt/β et TGF-β la diaphonie des voies de signalisation dans la fibrose rénale. L’expression de l’ARNm du TGF-β a été induite dans les reins de Souris IRC, et une telle induction a été diminuée par des souris exogènes Wnt1, mais pas ICG-001 (Figure 4F). Par conséquent, le prétraitement de Wnt1 exogène inhibe la Wnt/β-caténine rénale endogène signalisation chez les souris CKD.

FIGURE 5 | Expression in vivo de Wnt1 exogène avant que l’IR ne régule à la baisse les gènes cibles de Wnt/β-caténine rénale chez la souris après progression de l’IRA-IRC

(A, B)ARNm expression de PAI-1 et MMP-7 dans différents groupes comme indiqué.(C–E)Analyses par transfert Western représentatives des niveaux de protéines PAI-1 et Klotho.(F)ARNm expression de Klotho. *P< 0.05;="" **p="">< 0.01.="" n="">

Expression in vivo de Wnt1 exogène Avant que l’IR ne régule à la baisse les reins Gènes cibles Wnt/β-caténine chez la souris

Par rapport aux souris Sham, l’expression de l’ARNm de PAI-1 et MMP-7, deux cibles directes en aval de Wnt/β-caténine signalisation, a été significativement régulée à la hausse dans les reins de souris à 11 jours après l’UIRI(Figures 5A, B). Prétraitement de Wnt1 exogène, mais pas ICG-001, a inhibé l’expression de l’ARNm PAI-1 et MMP-7 chez les souris atteints d’IRC. Analyse western blot a montré que les niveaux de protéines PAI-1 étaient augmentés dans les reins des souris atteintes d’IRC, où ont été abolies par prétraitement de Wnt1 exogène, mais pas ICG-001(Figures 5C, D). Klotho est un antagoniste endogène de Wnt par liaison et séquestration Ligands Wnt. Par rapport aux souris Sham, les deux ARNm et les niveaux de protéines de Klotho ont diminué dans les reins de souris 11 jours après l’UIR(Figures 5E, F). Prétraitement de Wnt1 exogène, mais pas ICG-001, presque complètement restauré Expression de l’ARNm et des protéines Klotho dans les reins des souris atteintes d’IRC. Ces résultats suggèrent en outre l’effet inhibiteur de Wnt1 exogène sur la signalisation endogène Wnt/β-caténine dans reins de souris ATTEINTSC.

Expression in vivo de Wnt1 exogène Avant que l’IR ne réduise la fibrose rénale dans Souris après une lésion rénale aiguë - Chronique Progression de la maladie rénale

Nous avons ensuite étudié l’effet de l’activation de Wnt/β-caténine avant IR sur les gènes de la matrice rénale et les lésions fibrotiques chez les souris IRC. Par rapport aux souris Sham, l’expression de l’ARNm de la fibronectine (FN), le collagène I, le collagène III et le α-SMA ont été nettement induits dans les reins de souris 11 jours après l’UIR(Figures 6A–D). Ces altérations ont été atténuées par le prétraitement des exogènes Wnt1, mais pas ICG-001. L’analyse par transfert de Western a montré que le les niveaux de protéines de FN et de α-SMA ont été significativement augmentés en reins de souris atteintes d’IRC, et de telles altérations ont été abolies par prétraitement de Wnt1 exogène, mais pas d’ICG-001(Figures 6E– G). Les effets de Wnt1 et ICG-001 exogènes sur le FN l’expression des protéines chez les souris atteints d’IRC a été validée par les reins immunocoloration avec un anticorps FN(Figure 6H). Ces résultats suggèrent que le prétraitement de Wnt1 exogène prévient les reins fibrogenèse chez les souris atteintes d’IRC induites par l’IR.

FIGURE 6 | L’expression in vivo de Wnt1 exogène avant IR réduit la fibrose rénale chez la souris après progression de l’IRA-IRC

(A–D)expression de l’ARNm de la fibronectine, collagène I, collagène III et α-SMA.(E–G)Analyses par transfert Western représentatives des niveaux de fibronectine et de protéines α-SMA-SMA.(H)Immunocoloration de la fibronectine dans sections rénales. *P< 0.05;="" **p="">< 0.01;="" †p="">< 0.05.="" n="5." scale="" bar,="" 50="">

Expression in vivo de Wnt1 exogène Avant que l’IR n’atténue l’inflammation rénale Après une lésion rénale aiguë - Rein chronique Progression de la maladie

Par rapport aux souris Sham, l’expression de l’ARNm de les gènes inflammatoires, tels que l’IL-1, l’IL-6 et le TNF-α, étaient significativement régulé à la hausse dans les reins de souris à 11 jours après L’UIR(Figures 7A–C). De telles modifications étaient presque complètement aboli par prétraitement de Wnt1 exogène, mais pas d’ICG-001. L’analyse par transfert western a montré que les niveaux de protéines des deux P65 et sa forme phosphorylée (p-p65) ont été nettement augmentées en reins de souris 11 jours après UIRI, indiquant l’activation de signalisation NF-κB chez les souris CKD(Figures 7D–F). Notamment pré-traitement de Wnt1 exogène, mais pas d’ICG-001, de manière significative réduction des niveaux de protéines p65 et p-p65 dans les reins des souris atteintes d’IRC. Ces résultats indiquent que le prétraitement de Wnt1 exogène prévient les réponses inflammatoires rénales chez les souris atteintes d’IRC.

FIGURE 7 | L’expression in vivo de Wnt1 exogène avant IR atténue l’inflammation rénale chez la souris après progression de l’IRA-IRC

(A–C)expression de l’ARNm de l’IL-1, de l’IL-6, et le TNF-α dans les reins de souris.(D–F)Analyses par transfert Western représentatives des niveaux de protéines p65 et p-p65. *P< 0.05;="" **p="">< 0.01.="" n="">

Wnt1 exogène protège les cellules tubulaires Contre l’apoptose induite par Lésion d’hypoxie-réoxygénation in vitro

Pour mieux cerner le rôle de Wnt1 dans l’IRA, nous avons créé Modèles de cellules tubulaires HKC-8 d’IRA utilisant l’hypoxie-réoxygénation (H/R) traitement. La cytométrie en flux a été utilisée pour détecter l’apoptose et a révélé l’élévation du taux d’apoptose dans les cellules HCK8 après un traitement H/R(Figures 8A, B). Wnt1 exogène apoptose nettement réduite dans les cellules HCK-8 après un traitement H/R. Les analyses par transfert Western ont montré que le traitement H/R de manière significative augmenté les niveaux de protéines liées à l’apoptose, telles que FasL, p54, Bax et Parp-1 dans les cellules HCK-8(Figures 8C–G). Tel les altérations ont été diminuées par Wnt1 exogène. Ces données suggèrent que Wnt1 exogène protège contre les H/R induits apoptose dans les cellules tubulaires.

FIGURE 8 | Exogène Wnt1 protège les cellules tubulaires contre l’apoptose induite par une lésion d’hypoxie-réoxygénation (H/R) in vitro

(A)Analyses représentatives du FACS montrent que Wnt1 inhibait l’apoptose cellulaire induite par l’hypoxie/réoxygénation (H/R). Les cellules HKC-8 ont été pré-exprimées avec Wnt1 exogène, suivies d’une incubation dans conditions hypoxiques pendant 48 h, puis réoxygénation pendant 2 h.B) Le graphiquemontre le pourcentage de cellules apoptotiques dans différents groupes comme indiqué. Le Les cellules Annexine V positives marquées PE ont été comptées par cytométrie en flux. *P< 0.05="" versus="" controls;="" †p="">< 0.05="" versus="" h/r="" (n="3).">(C)Représentant Western blot les analyses montrent l’expression protéique de FasL, p53, Bax et Parp-1 dans les cellules HKC-8.(D–G)Les présentations graphiques montrent les abondances relatives de FasL, p53, Bax et Parp-1 dans les cellules HKC-8. *P< 0.05="" versus="" controls;="" †p="">< 0.05="" versus="" h/r="" (n="">

DISCUSSION

Bien que l’incidence de l’IRA augmente et constitue le risque majeur facteur de progression vers l’IRC, il n’y a pas de traitements efficaces pour la prévention et le traitement de l’IRA. Un certain nombre de situations, tels que la chirurgie cardiaque, les dépôts intra-tubulaires et l’administration des médicaments néphrotoxiques, pourrait conduire au développement de l’IRA (Mas-Font et al., 2017). Cela souligne la nécessité d’une mesures de l’IRA.

Bien que de nombreuses études soutiennent les effets bénéfiques de Wnt/β-caténine dans la pathogenèse de l’IRA, il reste insaisissable sur l’effet préventif des agonistes de la Wnt/β-caténine sur AKI. Une nouvelle conclusion de la présente étude est qu’in vivo expression de Wnt1 exogène avant que l’IR ne puisse protéger les souris contre l’IRA et prévenir la progression de l’IRA vers l’IRC. In vivo expression de Wnt1 exogène à 2 jours avant la bilatérale rénale L’IR a pu activer la β-caténine rénale, ce qui a entraîné une réduction apoptose rénale et inflammation chez les souris IRA (1 jour après l’IR). De plus, expression in vivo de Wnt1 exogène à 3 jours avant que l’IR unilatérale rénale n’inhibe la Wnt/β-caténine endogène signalisation et prévention du développement de la fibrose rénale chez Souris IRC (11 jours après IR). En revanche, l’expression in vivo de Wnt1 exogène 5 jours après qu’il a été démontré que l’IR rénale induisait β-caténine et accélérer la progression de l’IRA vers l’IRC (Xiao et al., 2016). Ces études suggèrent que le moment de l' Les agonistes de la caténine Wnt/β sont un facteur important lorsqu’ils sont utilisés pour la prévention et le traitement de l’IRA.

Des études suggèrent qu’une activation soutenue de Wnt/β-caténine la signalisation pourrait conduire la progression de l’IRA vers l’IRC. ICG001 inhibe sélectivement la protéine de liaison Wnt/β-caténine/CREB (CBP) et fait actuellement l’objet d’un essai clinique pour divers Cancers. Nous avons précédemment montré que l’administration d’ICG-011 5 jours après que l’IR a rétabli la fonction rénale et entravé la progression de l’IRA vers l’IRC, comme en témoigne la réduction rénale fibrose (Xiao et coll., 2016). En outre, l’administration de l’ICG-001 à partir de 3 jours après l’obstruction urétérale unilatérale (UUO) capable d’atténuer les lésions fibrotiques rénales dans les modèles UUO d’IRC souris (Hao et coll., 2011). Toutefois, la présente étude a montré que pré-traitement de l’ICG-001 3 jours avant que l’IR n’ait eu aucun effet sur la signalisation rénale Wnt/β-caténine ou la progression de l’IRA vers CKD. Ce n’est pas surprenant car la signalisation Wnt/β-caténine est exprimé à des niveaux très faibles dans les reins adultes non blessés (Tan et coll., 2014). Néanmoins, nos constatations suggèrent que le moment et la durée d’administration de l’ICG-001 est essentielle pour déterminer son résultat thérapeutique.

Mécanismes sous-jacents à l’effet protecteur de Wnt/β-caténine peut impliquer la modulation de l’apoptose et des voies de survie. L’ablation génétique du tubule β-caténine favorise l’apoptose tubulaire après traitement à l’IRI ou à l’acide folique, alors que l’activation de Wnt/β-caténine supprime les protéines pro-apoptotiques (Wang et al., 2009; Zhou et coll., 2012). Dans la présente étude, exogène Wnt1 a nettement inhibé l’apoptose des cellules tubulaires dans les deux IRI modèles murins d’IRA et modèles cellulaires induits par H/R d’IRA. Cela suggère que l’apoptose pourrait être un mécanisme potentiel sous-jacents à l’effet préventif de Wnt1 exogène sur l’IRA et Progression de l’IRA à l’IRC. La présente étude a également démontré un effet inhibiteur de Wnt1 exogène sur l’activation de NF-κB dans à la fois AKI et CKD, indiquant la suppression de l’inflammation réponse. Cependant, il convient de noter que si réduit l’inflammation est un effet secondaire à la protection ou à la mécanismes de protection médiés par des restes exogènes de Wnt1 à déterminer. D’autres études sont nécessaires pour élucider le mécanisme exact de la protection exogène médiée par Wnt1 contre l’IRA et la prévention de l’IRA à la progression de l’IRC.

Utiliser des modulateurs Wnt/β-caténine pour prévenir et traiter l’IRA et l’IRC

CONCLUSION

En conclusion, la présente étude fournit les preuves à l’appui l’effet préventif de l’activation de la Wnt/β-caténine sur l’IRA et l’IRC liées à l’IR, bien que des travaux supplémentaires soient nécessaires pour élucider le les mécanismes par lesquels Wnt1 exogène protège contre l’IRA et CKD. Compte tenu du double rôle de la signalisation Wnt/β-caténine dans l’IRA et CKD, la présente étude souligne l’importance du timing lors de l’utilisation de modulateurs Wnt/β-caténine pour la prévention et traitement de l’IRA. Études futures utilisant plus de pharmacologic et les approches génétiques ainsi que le moment optimal du traitement et durée sont justifiées pour étudier l’effet de Wnt/β-caténine agonistes dans la prévention et le traitement de l’IRA.

FROM: Exogène Wnt1 prévient les lésions rénales aiguës et leur progression ultérieure vers une maladie rénale chronique,Xue Hong^1†, Yanni Zhou^2†, Dedong Wang^3†, Fuping Lyu⁴, Tianjun Guan³, Youhua Liu^1,5et Liangxiang Xiao^{3 *}

Devant. Physiol., 08 novembre 2021 | https://doi.org/10.3389/fphys.2021.745816