Potentiel antioxydant et anti-âge d'une formulation peptidique (Gal2-Pep) conjuguée à l'acide gallique
May 04, 2023
La peau est très vulnérable au vieillissement prématuréen raison d'un stress externe, donc, dans cette étude, une formulation peptidique, (galloyl)2–KTPPTTP (Gal2–Pep) a été synthétisé en combinant le peptide TPPTTP, et gallicacide (GA). Tous les peptides ont été synthétisés sur une résine de chlorure de 2-chlorotrityle en utilisant un peptide en phase solidesynthèse (SPPS), et analysée sur une ionisation par électrospray (ESI)/quadripôle-temps-de-FLFLight (Q-TOF) système de spectroscopie de masse en tandem (MS). Initialement, Gal2–Pep n'a montré aucune toxicité en dessous de la concentration 100mM avec un taux de survie cellulaire de 88 % pour les kératinocytes etfibroblastes. Leles espèces réactives de l'oxygène(ROS) activité de piégeage de Gal2–Pep était plus stable par rapport à l'AG seul ; et après quatre semaines dans la chambretempérature, saActivité de récupération des ROSest resté supérieur à 50 %. De plus, la formulation peptidique,Fille2–Pep a également montré un effet inhibiteur de l'élastase dans CCD-1064Skfibroblastecellules. Sur la base des résultats de la RT-qPCR, il a été prouvé dans cette étude que Gal2–Pep a augmenté l'expression de PGC-1a pourprévenirstress oxydatif, et validé son potentiel en tant queagent anti-âgeparaugmenter l'expression decollagène de type Iet pardiminution de l'expression de la métalloprotéinase matricielle -1 (MMP1). Lerésultats obtenus renforcent la suggestion que la formulation peptidique synthétisée dans cette étude pourrait être utilisée commeantioxydant natureletagent anti-âgepour ses applications cosmétiques.
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1. Introduction
Vieillissement cutanése produit à la suite de la diminution progressive et de l'arrêt éventuel de la division cellulaire des kératinocytes et des broexplosions dans la peau. Les rides sur la peau se développent à mesure que le nombre de cellules diminue, entraînant une dénaturation de la matrice extracellulaire entraînant une sécheresse et une perte d'élasticité dans la peau.1 Dommages à l'ADN mitochondrial intracellulaireet une réduction du taux de synthèse des protéines se produit égalementpendant le processus de vieillissement de la peau.2 Le vieillissement cutané a deux voies principalesvoies, intrinsèques et extrinsèques, avec exposition aux ultraviolets (UV)
un moteur majeur devieillissement extrinsèque. La lumière UV réagit avec les principaux composants de la peau, y compris les lipides, les protéines et les acides nucléiques, pour produire des espèces réactives de l'oxygène (ROS) qui conduisent à la celluledécès.3–5 Des niveaux excessifs de ROS conduisent également au clivage etliaison anormale des chaînes de collagène ou d'élastine et favorise l'expression des métalloprotéinases matricielles (MMP), telles que les MMP-1, qui décomposent le collagène, entraînant le plissement de la peau etaccélérant le vieillissement cutané.6,7 Par conséquent, une thérapie antioxydante pour éliminerLes ERO et d'activer le potentiel mitochondrial ont le mérite de protéger la peau du vieillissement.
En plus des ROS, l'élastase a un rôle important dans la perte del'élasticité de la peau, qui décompose l'élastine, une protéine importante dumatrice extracellulaire.8 L'élastine, en raison de son recul élastique importantcaractéristiques, donnent de l'élasticité à la peau, alors que l'élastase ala capacité de cliver l'élastine et d'autres protéines.8 Par conséquent, inhibition de l'enzyme élastase pourrait être une stratégie clé pour le relâchement cutané via prévenir la perte d'élasticité de la peau.
Dans cette étude, nous avons conçu un nouveau matériau qui combine lescoactivateur gamma du récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes1-alpha (PGC-1a)-peptide dérivé TPPTTP et acide gallique (GA)pour une utilisation dans les cosmétiques anti-âge. GA est un phytochimique trouvé dans divers fruits et légumes, y compris les raisins, les tomates et le thé vert, qui est connu pour avoir un haut pouvoir antioxydant et antibactérien. eFfects.9 Bien que GA soit utilisé dans les industries cosmétiques et alimentaires en raison de ces avantagesFfects, sa formulation a tendance à être instable.10 On a ainsi développé (galloyl)2–KTPPTTP (Gal2–Pep) afin d'augmenter la stabilité de GA en le liant au PGC-1a-peptide TTPTTP dérivé.
Dans cette étude, nous avons synthétisé un (galloyl)2–KTPPTTP (Gal2– Pep) formulation peptidique en conjugaison avec l'acide gallique et confirméeson potentiel en tant qu'agent antioxydant et antivieillissement.
2. Matériels et méthodes
2.1. Matériaux
Modifié par DulbeccoEagle's Medium (DMEM), pénicilline/streptomycine, sérum fœtal bovin (FBS), phosphate-buFferedune solution saline (PBS) et de la trypsine ont été achetées chez Gibco (Carls
mauvais, CA). Hydroxybenzotriazole (HOBt), diisopropyl carbodiimide (DIC), 1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU),N, N-diisopropyléthylamine (DIEA), acide gallique etN-succinyl-tri-alanyl-pnitroanilide ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).L-Forme des acides aminés (Fmoc-Lys (Boc)–OH, Fmoc-Thr (tBu)–OH et Fmoc-Pro–OH) ont été achetés chez Bead-Tech (Séoul,Corée).
2.2. Synthèse de peptides et de peptides couplés à l'acide gallique
Tous les peptides ont été synthétisés sur une résine de chlorure de 2-chlorotrityle (200méchelle mol, valeur de substitution¼ 1,46 mmol·g 1) en utilisant HOBt–Synthèse peptidique en phase solide médiée par DIC (SPPS).
La synthèse peptidique à l'aide de la méthode SPPS a été réalisée avec de légères modications se référant à des études antérieures.11–13 Le 2-La résine de chlorure de chlorotrityle (CTC) a été gonflée dans du dichloro
méthane (DCM, 8 mL) pendant 30 min. La résine a été lavée avecdiméthylformamide (DMF). Toutes les réactions ont été réalisées à température ambiante. Dérivés d'acides aminés protégés par Fmoc (2 équivalents(Équiv.), pour leFipremier acide aminé attaché ou 5 équiv., pour les autres acides aminés) ont été couplés avec soit DIEA (5 équiv., pour un acide aminé attaché) soit HOBt/DIC (6 équiv./5 équiv.) dans du DMF apieuheffectuer la déprotection de Fmoc en utilisant 2 % (v/v) de DBU dans du DMF (2 fois, 2 min à la fois, 8 ml). Et toutes les étapes ont été lavées 5 fois avec du DMF. L'acide gallique final a été couplé avec des peptides attachés à la lysine.Après le couplage de l'acide gallique, la résine a étéaltré, lavé,et séché sous vide poussé. La solution de clivage (TFA :eau déminéralisée [DI] : TIS¼ 95 : 2,5 : 2,5, v/v/v pour cent ) a été traité pendant 2 hpour obtenir les peptides bruts. Les peptides bruts ont été précipités et lavés trois fois avec de l'éther diéthylique froid.
Chromatographie liquide haute performance analytique en phase inverse(RP-HPLC) a été réalisée sur un Waters 2695 SeparationsModule avec une colonne Capcell Pak C18 (4,6 mm 250 millimètres, 5mm, Shiseido). La phase mobile consistait en 0.05 % de TFA en H2O (phase mobile A) et 0.05 % de TFA dans l'acétonitrile (phase mobile B).
L'élution a été obtenue en utilisant un gradient linéaire pour les mobilesphase B de 5 % à 65 % sur 30 min à unedébit de 1.0 mL min 1. Les pics peptidiques ont été détectés à une longueur d'onde de 230 nm. La RP-HPLC semi-préparative a été réalisée sur un système HPLC Waters (Pump 600E, Detector UV-484) avec un Gemini RP-C18colonne (21,2 mm 250 millimètres, 5mm, Phénoménex). La phase mobile consistait en 0.05 % de TFA en H2O (phase mobile A)et 00,05 % de TFA dans l'acétonitrile (phase mobile B). L'élution a été réalisée en employant un gradient linéaire pour la phase mobile B de7 pour cent à 22 pour cent sur 15 min à unldébit de 10 mL min 1. Leles pics peptidiques ont été détectés par spectrophotométrie à une longueur d'onde de 230 nm.
Les peptides synthétisés ont été dissous dans de l'acide formique à 5 % dans de l'eau et analysés par ionisation par électrospray (ESI)/quadripôle-temps-de-lspectroscopie de masse en tandem ight (Q-TOF)(MS) (TripleTOF6600, ABSciex, Foster City, CA). Les échantillons ont été injectés dans le système Q-TOF équipé deune source de nano-spray à unldébit de 1mL min 1. L'ion ESIles paramètres de la source étaient les suivants : une tension de pulvérisation ionique de 1,5 kV, un gaz rideau à 10 psi et un gaz gaine à 5 psi. Les spectres dansmode full-scan et MS/MS ont été collectés dans la plage dem/z
100–1200 Da à un temps d'accumulation de 25 ms par spectre.L'énergie de collision est passée de 10 à 80. La résultanteles données ont été acquises à l'aide d'Analyst TFware et automatiquementattribué par centroïde 80 % avec un pic minimum, une réduction du bruit de 10 %, un désisotoping moyen avec un seuil de 3 %, aucune réduction du bruit et aucun lissage. Les peptides synthétisés ont été identifiésavec une tolérance de masse de 0.05 Da et séquencé manuellement en utilisant une tolérance MS/MS de 0.01 Da.
2.3. Cultures cellulaires et tests de viabilité
Cellules humaines, adultes, à faible teneur en calcium et à haute température (HaCaT)et CCD-1064Sk (peau humaine normalefibroblastes) ont étécultivée dans du DMEM avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline/streptomycine. Les cellules ont été incubées à 37 C dans une chambre à air humidifiée avec 5 % de CO2.Pour les tests de viabilité, le kit de comptage cellulaire -8 (CCK-8, Dojindo Co. Ltd. Pékin, Chine) a été utilisé. Cellules HaCaT et CCD-1064Skont été ensemencés dans des microplaques 96-puits (5 103 cellules par puits) et incubé à 37 C dans 5 % de CO2 pendant 24h. Les cultures ont ensuite été exposées à différentes concentrations des peptides synthétisés ou GA et incubées à 37 C dans 5 % de CO2 pendant 24h. Viabilité cellulairea ensuite été mesuré à l'aide d'un CCK-8 conformément aux directives du fabricant.
2.4. Détermination de l'activité antioxydante
2.4.1. Dosage DPPH.L'activité antioxydante de la substance synthétiséeles peptides et GA ont été évalués individuellement en utilisant le test DPPH. Les dosages DPPH ont été effectués à la suite d'un rapport précédemment
méthodologie avec modifications mineurescation.12,14–16 Tout d'abord, un 0.12 mg ml 1 Une solution de DPPH a été préparée dans du méthanol, puis 100mL de solution DPPH et 100mL des peptides synthétisés ou GA ont été mélangés à différentes concentrations ({{0}}.1 mM, 0.05 mM, 0.01 mM et 1mM) dans des 96-microplaques à puits. Dans un incubateur à agitation orbitale, leles mélanges ont été mis à réagir pendant 30 min à 37 C et 100 tours sanslumière. L'absorbance a ensuite été mesurée à 517 nm et la capacité antioxydante a été calculée.
2.4.2. Activité de piégeage des ROS.
L'activité intracellulaire de piégeage des ROS a été évaluée à l'aide d'un kit de diacétate de 20,70-dichlorofluorescéine(DCF-DA, Abcam, États-Unis). Les cellules HaCaT ont été ensemencées dans des microplaques 96-puits (5 103 cellules par puits) et incubé à 37 C pendant 24h.ApiAprès incubation, les cultures ont été exposées aux peptides synthétisés ou GA (100mM) et incubé à 37 C pendant 24h. Les cellules ont ensuite été exposées à 10mM DCF-DA solution et incubé pendant 30 min. UNpiAprès incubation, la solution a été lavée avec du PBS. Leles cellules ont été analysées à l'aide d'un lecteur de microplaques à l'excitation et
longueurs d'onde d'émission de 485 nm et 530 nm, respectivement.
Fig. 1Confirmation de l'étape de synthèse et de la séquence des peptides à l'aide du temps quadripolaire devol(Q-TOF) spectrométrie de masse : (a) procédure de synthèse détaillée (b) TPPTTP, (c) galloyle–TPPTTP, et (d) (galloyle)2–KTPPTTP.
2.5. Dosage du potentiel de la membrane mitochondriale
Le colorant JC-1 (Thermo Fisher, USA) a été utilisé pour la mitochondriedosage du potentiel membranaire (MmP). Des cellules CCD-1064Sk et HaCaT ont été ensemencées dans des microplaques 96-puits (5 10 3cellules par puits)
et incubé à 37 ans C et dans 5 % de CO2 pendant 24h. À l'arrièreer incubation,les cultures ont été exposées à différentes concentrations des peptides synthétisés et incubées à 37 C dans 5 % de CO2 pendant 24h.Le colorant JC-1 a été ajouté aux cellules CCD-1064Sk et HaCaT pourproduire un concentration finale de 10mM. ApiAprès 10 min d'incubation, les cellules ont été lavées deux fois avec 37 C PBS. Vert et rougefluorescenceont été mesurés à l'aide d'un Varioskan LUXLecteur de microplaques multimode (ThermoFisher, USA) à un excitation (lEx)/émission (lEm) de 475/530 nm et unlEx/lEmde 475/590 nm, respectivement.
2.6. Test d'activité inhibitrice de l'élastase
Les cellules CCD-1064Sk ont été ensemencées dans des plaques 6-puits et incubées à 37 C dans 5 % de CO2 pendant 24h. Les cultures ont ensuite été exposées à une concentration de 100mM des peptides synthétisés ou GA et incubés à 37 C dans 5 % de CO2 pendant 24h. Les cellules ont été lavées deux fois avec du dPBS et nous avons collecté chaque cellule à l'aide d'un grattoir à cellules. UNeuh en ajoutant 0.2 M Tris–HCl (pH 8.0) avec 0.1 % de Triton-X à la valeur collectéecellules, les cellules ont été homogénéisées par un ultrasonateur. La solution homogénéisée a été centrifugée pendant 20 min à 3000 rpmet 4 C. Ensuite, unpieuh en prenant le surnageant, protein quanti-cation a été réalisée en utilisant le test de protéine BCA. Protéines pour chacunl'échantillon a été distribué auFiconcentration finale de 100mgml 1, etN-succinyl-tri-alanyl-p-nitroanilide a été ajouté à laconcentration finale de 1,6 mM et mis à réagir à 36 C pendant 1h.Ensuite, l'absorbance a été mesurée à 405 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques.
2.7. RT-qPCR
Les niveaux d'ARNm des marqueurs anti-âge dans les cellules CCK-1064Skont été évalués par RT-qPCR. L'ARN total a été recueilli à l'aide du réactif TRIzol (Life Technologies, Carlsbad, CA) et inverse
transcrit à l'aide du kit de réactifs PrimeScript RT (Takara BioInc., Kusatsu, Japon). Un système CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) et iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Labora
conservateurs) ont été utilisés pour la RT-qPCR.b-L'actine a été utilisée pour normaliser les niveaux d'ARNm du collagène de type I, MMP-1 et PGC-1a.
2.8. analyses statistiques
Les données sont présentées comme la moyenne écart type detrois mesures indépendantes et analysées à l'aide de Studentt-tests, avec unp < 0.05 considered to be a signidifférence de pente.
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