Réponses biochimiques et histopathologiques de Biomphalaria Alexandrina au RIPEX (régulateur de croissance des plantes)Ⅱ

3. Résultats

3.1 Toxicité RIPEX

Les résultats de toxicité de RIPEX pour Biomphalaria alexandrina après 1 jour ont indiqué que les valeurs de CL50 et CL90 étaient respectivement de 39,9 5 et 73,6 µL/L. Les concentrations sublétales de Te LC10 et LC20 étaient respectivement de 8 et 16 µL/L (Tableau 1 et Fig. 1).

3.2 Effet du RIPEX sur les marqueurs du stress oxydatif

L'exposition au RIPEX a affecté les activités de la SOD et de la GST et les niveaux de MDA dans la glande digestive de B. Alexandrina (tableau 2). Les escargots exposés au RIPEX à 8 µL/L ont montré une augmentation insignifiante (p=0.6) de l'activité de la SOD par rapport aux escargots témoins. Cependant, les escargots B. alexandrina exposés à 16 µL/L pendant 7 jours ont présenté une réduction significative de l'activité SOD (p=0.05). L'activité GST a augmenté de manière significative (p inférieur ou égal à 0,001) après exposition aux deux concentrations. La plus forte augmentation a été notée chez les escargots exposés à 16 µL/L pendant 1 jour (39,7±3,2 U/mg) et la valeur la plus élevée à la concentration de 8 µL/L était (33,7±1,7 U/mg) à 7 jours, par rapport à les témoins à 17,1 ± 3,6 U/mg (après 1 jour) et 22,6 ± 1,3 U/mg (après 7 jours).

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En fonction des intervalles de temps, une exposition pendant 7 jours a provoqué une augmentation significative (p=0.0{{20}}3). L'exposition à différentes concentrations de RIPEX a provoqué une augmentation significative (p inférieur ou égal à 0,04) des niveaux de MDA. La concentration de 8 µL/L a augmenté le taux de MDA (45,06±4,1) par rapport au témoin (16,4±2,1). En fonction du temps d'exposition, les niveaux de MDA étaient de 45,06 ± 4,1 et 56,1 ± 0,7 nmol/g aux concentrations de 8 et 16 µL/L, respectivement, contre 13,5 ± 0,7 nmol/g pour le témoin (tableau 2).

3.3 Effet du RIPEX sur l'activité des hormones stéroïdes

L'exposition à 16 µL/L a entraîné une augmentation significative de la concentration de testostérone (52,6 ± 2,5 nmol/L) (p=0.002) par rapport au témoin (34,6 ± 2,3 nmol/L). Alors que la concentration de 8 µL/L RIPEX a provoqué une augmentation significative (p=0.005) de la testostérone après 3 jours d'exposition par rapport à 16 µL/L. En fonction des intervalles de temps, il n'y a pas de signification sauf la diminution significative de la concentration de testostérone qui s'est produite à 7 jours (19,6 ± 2 nmol/L) d'exposition (p=0.003) par rapport à 3 jours (47,3 ± 6 nmol/L). Concernant l'estradiol, il y a eu une augmentation significative (p=0.003) de la concentration hormonale après 3 jours d'exposition à 16 µl/L (73,6±3,5 pg/mL par rapport au témoin (43,3 pg/mL) et 7 jours d'exposition à 8 µL/L (56,3±1,5 pg/mL par rapport au témoin (50,3±5,6 pg/mL) (Fig. 2, b).

3.4 Effet du RIPEX sur les enzymes du potentiel immunitaire

L'exposition de B. Alexandrina à deux concentrations de RIPEX a provoqué une augmentation significative de l'activité de l'enzyme MPO (Fig. 3a) en fonction du temps d'exposition à 3 jours (p=0.0{ {35}}4) et 7 jours (p=0.01). L'exposition à 8 µL/L de RIPEX a significativement augmenté l'activité de la MPO (55,3±4,8 mU/mg de protéine (p=0.004) par rapport à 15,4±1,2 mU/mg pour le contrôle. Alors que 16 µL/L exposés escargots, l'activité était (53,03 ± 2,3 mU/mg de protéine et 73,9 ± 2,8 mU/mg de protéine, p inférieur ou égal à 0,05). De plus, la concentration de 16 µL/L a provoqué une augmentation significative (p=0 0,05) dans l'activité par rapport à 8 µL. Les deux concentrations (8 et 16 µL/L) ont significativement augmenté (p inférieur ou égal à 0,009) l'activité de l'ADA par rapport au contrôle (Fig. 3b) à tout moment L'augmentation de l'activité à une concentration de 16 µL/L Selon les intervalles de temps, l'exposition pendant 7 jours a enregistré une augmentation significative par rapport à 1 jour et 3 jours (p inférieur ou égal à 0,05). l'activité à 7 jours était de 27,03 ± 14 et 74,3 ± 1,9 U/mg de protéine

3.5 Numération différentielle des hémocytes

L'examen d'échantillons d'hémolymphe d'escargots B. alexandrina a indiqué trois types d'hémocytes morphologiquement distincts; hyalinocytes, petits ronds et hémocytes étalés. Les hyalinocytes sont caractérisés par leur forme circulaire, leur membrane cellulaire claire et dense et leur grand rapport noyau/cytoplasme. Elle est représentée par un nombre élevé dans le contrôle (56,3±0.5, 1 jour). Les petites cellules rondes sont des cellules intermédiaires avec peu de granules cytoplasmiques et pas de pseudopodes. Les hémocytes en propagation ont des tailles différentes, avec un petit noyau et de gros granules cytoplasmiques. Ce sont des cellules phagocytaires car elles peuvent former des pseudopodes peu nombreux et à courte propagation. L'exposition aux deux concentrations de RIPEX a augmenté le nombre d'hémocytes, et une augmentation significative a été observée dans les granulocytes d'escargots exposés à 8 µL/L (p=0.02) et 16 µL/L (p{{12 }}.006) pendant 1, 3 et 7 jours par rapport au témoin. (Tableau 3). Le traitement a provoqué certaines anomalies morphologiques des hémocytes telles que des hyalinocytes avec un allongement filopode, des granulocytes déformés avec des vacuoles et des filopodes étalés (Fig. 4).

3.6 Effet du RIPEX sur l'histopathologie des glandes digestives et de l'ovotestis

Les glandes digestives de B. Alexandrina sont composées de tubules et chaque tubule est constitué d'une couche de cellules épithéliales cylindriques différenciées en cellules digestives et sécrétoires, disposées autour d'une lumière centrale (Fig. 5a). Les tubules sont reliés entre eux par du tissu conjonctif. L'exposition au RIPEX a provoqué certaines altérations, telles que la dégénérescence du tissu conjonctif. Les escargots exposés à 8 µL/L ont montré la présence de bulles cellulaires, qui indiquent la mort des cellules et l'obstruction de la lumière. Des aliments non digérés ont été observés (Fig. 5b – d). Les escargots exposés à 16 µL/L présentaient une dégénérescence des cellules tapissées avec certains signes pathologiques tels que la vacuolisation et la dilatation de la lumière. Le tubule est devenu endommagé, déformé et nécrotique (Fig. 5e, f).

Les ovotestis des escargots témoins B. alexandrina sont constitués de plusieurs acini reliés par du tissu conjonctif. Chaque acinus est tapissé d'un épithélium germinal composé de différents stades de spermatogonies et d'ovogonies. Ils se différencient en ovocytes primaires, secondaires et un ou deux ovocytes matures (oogones). Les spermatozoïdes matures se trouvent en groupes à l'intérieur de l'acinus (Fig. 6a). La structure histologique de l'ovotestis des escargots exposés a changé après 7 jours d'exposition au RIPEX. Chez les escargots exposés à 8 µL/L, un nombre croissant de spermatozoïdes, des spermatozoïdes nécrotiques et une atrophie ont été observés. La déformation des gamétocytes mâles ou femelles et la dégénérescence des acini étaient également abondantes. De plus, l'exposition à 16 µL/L a rendu les acini plus dégénérés et la nécrose a augmenté (Fig. 6b – e).

4. Discussion

Les RPG sont largement utilisés dans les pratiques agricoles. Ces substances ont de nombreux effets délétères sur les organismes vivants. La présente étude visait à évaluer les impacts toxicologiques du RIPEX (un pesticide organophosphoré contenant de l'éthéphon contenant 48 % d'éthéphon comme ingrédient actif plus 52 % d'ingrédients inertes). Les tests de toxicité de RIPEX avec B. Alexandrina ont indiqué que les valeurs CL50 et -LC90 1-jours étaient de 39,95 et 73,6 µl/L, respectivement.

Ces résultats ont été étayés par [54] qui a démontré la valeur EC50 de l'éthéphon contre des embryons de Daphnia magna (125 mg/L après 48 h d'exposition). Ce pesticide semble plus toxique pour Biomphalaria que d'autres formulations de composés organophosphorés tels que le chlorpyrifos (LC50 9.6 mg/L ; [30] et le profenofos (LC50 1.10 mg/L ; [10]) .

Une homéostasie existe entre la génération de radicaux libres d'oxygène et la production de molécules antioxydantes dans des conditions physiologiques normales [23]. Un déséquilibre entre les systèmes antioxydant et oxydant est connu sous le nom de stress oxydatif [32]. Chez les eucaryotes et les procaryotes, la superoxyde dismutase (SOD) et les glutathion S-transférases sont des enzymes antioxydantes cruciales qui peuvent éliminer trop d'oxygène des radicaux libres et protéger l'organisme des dommages oxydatifs [34, 38].

Ils participent également à la détoxification de plusieurs xénobiotiques [8, 15]. La présente étude a révélé que l'exposition des escargots B. alexandrina à des concentrations sublétales de RIPEX 48 % EC perturbait l'activité antioxydante des escargots exposés. Une exposition aiguë (24 h) a tendance à réduire les activités globales de SOD et de GST chez les escargots, suivie d'une augmentation après 3 jours d'exposition et d'une forte inhibition après 7 jours d'exposition.

Les niveaux de MDA étaient significativement plus élevés chez les escargots exposés par rapport aux témoins après toutes les périodes d'exposition. Ces résultats suggèrent un état de stress oxydatif chez les escargots induit par l'exposition au RIPEX. Les escargots ont subi une diminution soudaine des activités enzymatiques après 1 jour d'exposition et ont tenté de compenser en surproduisant des enzymes après 3 jours d'exposition. Cependant, au 7e jour d'exposition, les escargots étaient incapables de surmonter la production excessive d'espèces réactives de l'oxygène, comme en témoigne l'augmentation des niveaux de MDA (peroxydation lipidique), entraînant une inhibition de la production d'enzymes antioxydantes. Le MDA est l'un des impacts majeurs de la peroxydation des lipides et a le pouvoir de perturber l'échange d'ions dans la membrane cellulaire, de modifier la perméabilité aux ions et d'influencer la fonction enzymatique [9].

Le mécanisme du stress oxydatif induit par RIPEX 48 % EC chez Biomphalaria peut différer des autres pesticides organophosphorés. Il a provoqué une inhibition enzymatique seulement après 7 jours d'exposition. Cependant, le chlorpyrifos, par exemple, a provoqué une augmentation de l'activité SOD et une réduction de l'activité GST chez B. Alexandrina peu après 1 jour d'exposition [30]. La testostérone et l'estradiol jouent un rôle crucial dans la reproduction des escargots B. alexandrina [20, 45]. Les modifications de ces hormones peuvent être utilisées comme critère d'évaluation de la toxicité chimique [14]. RIPEX 48 pour cent EC a provoqué une perturbation hormonale chez les escargots B. alexandrina.

Les escargots exposés à 16 µL/L ont montré une augmentation significative de la testostérone après 3 jours d'exposition. Cependant, RIPEX a diminué les niveaux d'hormones chez les escargots exposés à 8 µL/L après 1 et 3 jours d'exposition. Concernant l'estradiol, l'hormone a tendance à augmenter chez les escargots exposés. Cependant, l'augmentation la plus importante a été observée chez les escargots exposés à 16 µL/L après 3 jours d'exposition. Le RIPEX peut donc avoir un effet perturbateur endocrinien sur les escargots B. alexandrina. Des résultats similaires ont également été rapportés par Ibrahim et Hussein [30], qui ont signalé une augmentation significative des niveaux de testostérone et d'estradiol après exposition de B. Alexandrina à des concentrations sublétales de chlorpyrifos 48% EC. Cependant, d'autres produits agrochimiques, tels que l'herbicide oxyfluorfène (24 % EC), ont réduit les niveaux de testostérone et d'17-œstradiol chez B. Alexandrina après deux semaines d'exposition [31]. La myéloperoxydase (MPO), qui convertit H2O2 en acide hypochloreux (HOCl), un antibiotique puissant, est souvent considérée comme la pierre angulaire de la cytotoxicité médiée par les ROS, et il existe des preuves solides que les hémocytes de mollusques ont une activité MPO comparable à celle des phagocytes de mammifères [22 , 44, 49]. L'adénosine désaminase (ADA) joue un rôle important dans le système immunitaire des animaux vertébrés et invertébrés, y compris les escargots Biomphalaria [51].

Son déficit est lié à la maladie d'immunodéficience combinée [25]. L'exposition de B. Alexandrina à 8 et 16 µL/L de RIPEX a provoqué une augmentation significative des activités des enzymes MPO et ADA dans les glandes digestives des escargots après 3 et 7 jours d'exposition. L'augmentation de l'activité enzymatique semble dépendante du temps et de la concertation. Les glandes digestives sont le site principal du métabolisme des contaminants chimiques chez les gastéropodes [46]. L'augmentation de ces enzymes suggère une réponse immunologique de B. Alexandrina à la toxicité du RIPEX puisque le MPO, par exemple, peut convertir les polluants en radicaux libres via des abstractions d'électrons uniques [41], ce qui peut entraîner des événements de cycle redox qui produisent des oxyradicaux et éventuellement initient peroxydation lipidique [36].

Les escargots dépendent principalement de la cytotoxicité à médiation cellulaire pour se débarrasser des objets envahisseurs [5, 53]. Les cellules défensives les plus étudiées chez les escargots sont les hémocytes. Les hémocytes progressent de petites cellules arrondies et agranulaires à de grandes cellules granuleuses et étalées via des phases intermédiaires [6, 53]. Les hémocytes granulaires phagocytent principalement les substances étrangères [28]. L'exposition à deux concentrations de RIPEX 48 % EC a augmenté le nombre d'hémocytes. Les hyalinocytes sont apparus avec des vacuoles dans des échantillons prélevés sur des escargots exposés. Une augmentation significative a été notée dans les granulocytes, indiquant une augmentation de la réponse immunitaire cellulaire de l'escargot pour défier la toxicité du RIPEX. Ibrahim et Hussein [30] ont montré que l'exposition de B. Alexandrina au chlorpyrifos avait des impacts négatifs sur la morphologie et le nombre total d'hémocytes des escargots exposés.

De plus, la microscopie optique a révélé que certains hyalinocytes avaient des noyaux rétrécis, une division cellulaire incomplète et la formation de pseudopodes. Ces effets sur le nombre d'hémocytes et la morphologie de B. Alexandrina ont une implication négative sur l'immunité des escargots, car ces organismes dépendent largement des hémocytes pour leur protection contre les rencontres étrangères. Les investigations histopathologiques des glandes digestives de B. Alexandrina ont montré que l'exposition au RIPEX pendant 7 jours provoquait certaines altérations pathologiques telles que la dégénérescence du tissu conjonctif, le saignement cellulaire et la dégénérescence des cellules lignées dans la lumière. Les tubules digestifs sont devenus endommagés, déformés et nécrotiques. L'histopathologie est un paramètre important dans l'évaluation des changements pathologiques chez les animaux aquatiques exposés aux contaminants [33].

La grande sensibilité des glandes digestives est directement attribuée à son rôle dans l'homéostasie, l'absorption des contaminants, la digestion, le métabolisme et le processus de détoxification [24]. Les effets observés peuvent être dus à une accumulation directe du RIPEX dans les cellules de la glande digestive ou indirectement via des dommages oxydatifs causés par la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS). En effet, le stress oxydatif extrême a été lié à des lésions tissulaires impliquant une variété de processus physiologiques et de variables environnementales, y compris la mort cellulaire nécrotique et apoptotique [19]. De plus, l'exposition à deux concentrations différentes de RIPEX pendant 7 jours a altéré la structure histologique de l'ovotestis avec augmentation du nombre de spermatozoïdes nécrotiques, atrophie, déformation des gamétocytes mâles ou femelles et dégénérescence des acini. Ces changements sont susceptibles de réduire le potentiel reproducteur des escargots et, par conséquent, leur adéquation dans le système aquatique.

5. Conclusion

Des concentrations sublétales de RIPEX 48 % EC ont eu un effet multiforme sur les escargots Biomphalaria alexandrina. Chez les escargots, l'exposition chronique au RIPEX a réduit la production des enzymes antioxydantes SOD et GST tout en augmentant la production de MDA, indiquant un état de stress oxydatif. De plus, il a eu un effet perturbateur endocrinien sur les escargots, comme en témoigne une augmentation globale des niveaux d'hormones stéroïdes. Le système immunitaire de l'escargot semble être vulnérable à l'exposition au RIPEX. Il a provoqué une augmentation significative de l'activité des enzymes MPO et ADA dans les glandes digestives des escargots après 3 et 7 jours d'exposition, ainsi qu'une augmentation significative des granulocytes dans les groupes d'escargots exposés. Des anomalies pathologiques dans les glandes digestives et les ovotestis des escargots exposés étaient également des signes de changements histopathologiques causés par l'exposition au RIPEX. Ces résultats montrent que le RIPEX nuit à la faune aquatique, y compris B. Alexandrina. Ainsi, les escargots Biomphalaria peuvent être utilisés comme bioindicateurs de la pollution environnementale avec des régulateurs de croissance des plantes.

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