Chapitre 5 Changements de l'activité enzymatique pendant la fermentation enzymatique

Chapitre 5 Changements de l'activité enzymatique pendant la fermentation enzymatique

 

Protéase, lipase etsuperoxyde dismutase (SOD)sont les principales enzymes fonctionnelles deAliments médicaux pour les enzymes. Parmi eux,protéasejoue un rôle dansPromouvoir l'hydrolyse des protéines dans les alimentsdans le corps humain. De plus, il peut également décomposer certaines cellules mourantes, éliminer la saleté sur la surface de la peau et les pores et jouer un rôle dans l'exfoliation, il est donc largement utilisé dans les produits du bain. La lipase agit sur la liaison ester entre les acides gras et le glycérol, et le substrat d'hydrolyse est généralement des huiles naturelles. Par conséquent, il est observé dans de nombreux aliments et produits de santé à perte de poids. De nombreuses femmes sont extrêmement préoccupées par le sujet de la perte de poids, c'est pourquoi les enzymes sont rapidement devenues populaires dans le monde entier.Les enzymes sont riches en lipase, ce qui signifie qu'ils ont une valeur de recherche élevée et des perspectives d'application.GAZONest une enzyme métallique spéciale qui catalyse la réaction de dimutation deRadicaux d'anion superoxydedoncÉlimination des radicaux d'anion superoxydedans le corps. Il s'agit d'une barrière protectrice pour les organismes, il est donc largement utilisé dans le domaine médical.
Ce chapitre prend une enzyme Apple comme exemple. À partir de l'étape initiale de la fermentation, leactivités de superoxyde dismutase, amylase, lipase, protéase et cellulase dans le groupe expérimental et le groupe témoin a été mesuré tous les 15 jours pour refléter de manière exhaustive et systématique la tendance changeante de l'activité enzymatique pendant tout le processus de fermentation.

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5.1 Matériaux et méthodes

5.1.1 Matériaux

(1) Matériaux expérimentaux

Lavez les pommes fraîches avec de l'eau stérile dans des conditions stériles, séchez-les naturellement sur une table de fonctionnement stérile, épluchez-les et coupez-les pour une utilisation ultérieure. Ajouter le sucre blanc et les pommes dans un bocal en verre stérilisé à un rapport de masse de 1: 1. Activez les bactéries nécessaires pour l'expérience et inoculez-les dans l'enzyme en fonction du schéma optimal (cette étape de fonctionnement est omise pour le groupe témoin), sceller et la placer dans un endroit frais et sec. Après 3 mois de fermentation à température ambiante, prélevez un échantillon pour obtenir l'ensemble du liquide enzymatique contenant la pulpe et filtrez-le. Prenez le surnageant comme échantillon expérimental. Une fois l'échantillon centrifugé à 10, 000 RPM pendant 15 minutes dans une centrifugeuse à grande vitesse, il est utilisé pour mesurer les données pertinentes. Il convient de noter que dans le processus de fabrication des enzymes, afin d'éviter une contamination inutile, toutes nos opérations ont été effectuées dans des conditions stériles.

(2) Instruments principaux
Les instruments requis pour l'expérience sont les mêmes que 3.1.1 (2).

 

5.1.2 Méthodes

(1) Détermination de l'activité de superoxyde dismutase (SOD) [66]
La solution de pyrogallol a été préchauffée dans un bain d'eau à température constante de 25 degrés pendant une période de temps. Selon le tableau 5.1, une quantité appropriée de tampon, de l'eau distillée et le même volume d'acide chlorhydrique ou de solution de pyrogallol ont été ajoutés au tube à essai. Le bain d'eau à température constante a été réglé à 25 degrés pour 2 0 min. Une fois le liquide mixte rapidement secoué, il a été immédiatement injecté dans la cuvette. La valeur d'absorbance A0 de l'échantillon a été mesurée toutes les 30 secondes à une longueur d'onde de 325 nm à l'aide d'un spectrophotomètre.

Tab.5.1 Ajouter la quantité du réactif adjacent de Benzène trois phénol pour la détermination du taux d'autoxydation

 

La méthode de détermination de l'activité SOD est fondamentalement la même que l'opération ci-dessus. La seule différence est qu'avant d'ajouter du pyrogallol, {{0}}. 5 ml d'échantillon d'enzyme La solution de différentes concentrations doit être ajoutée en premier. Dans le même temps, le même volume d'eau distillée est ajouté. L'absorbance mesurée est ASOD. Le taux d'inhibition et l'activité des enzymes SOD sont calculés selon la formule 5.1 et la formule 5.2: taux d'inhibition (%)=(△ a 0- △ ASOD) / △ A 0 × 100 (5.1) Activité enzyme (u / ml) =} Rate d'inhibition! (5.2) où: V1 est le volume total de la solution, ML; V2 est le volume de la solution d'échantillon enzymatique, ML; △ A0 est le taux d'auto-oxydation du pyrogallol; △ L'ASOD est le taux de variation de la valeur d'absorbance de l'échantillon; N est la dilution multiple (2) détermination de l'activité de l'amylase Cette étude a utilisé la méthode colorimétrique d'iode-starch pour déterminer l'activité de l'amylase. Les étapes de fonctionnement spécifiques se réfèrent à la «procédure nationale de fonctionnement du laboratoire clinique» [67]. Il est principalement divisé en deux points suivants:

 

① Préparation de la solution
Solution d'amidon tamponnée ({{0}}. 4g / l): pèse avec précision 9g de chlorure de sodium, 22,6 g de phosphate de dihydrogène anhydre et 12,5 g de dihydrogène anhydre. bouillons; Passer avec précision 0,4 g d'amidon soluble, le dissoudre dans 10 ml d'eau distillée, mélanger uniformément et s'adapter à une pâte; Injectez la solution d'amidon ajustée à une pâte dans la solution d'ébullition ci-dessus et lavez le bécher à plusieurs reprises jusqu'à ce que l'amidon soit complètement transféré vers la solution d'eau bouillante. Après avoir remué uniformément avec une tige de verre, refroidir à température ambiante, ajouter 5 ml d'une solution de formaldéhyde à 37% et diluer à 1 L avec de l'eau distillée. La valeur du pH de la solution est de 7,0 ± 0,1, et elle est placée au réfrigérateur pour une utilisation.
Solution mère d'iode (0. 1 mol / l): pèse avec précision 1,7835 g d'iodate de potassium et 22,5 g d'iodure de potassium dans un 500 ml propre
Le bécher, ajoute lentement et uniformément l'acide chlorhydrique concentré de 4,5 ml, remuant en continu pendant le processus d'addition, diluer à l'échelle avec de l'eau distillée et remuer uniformément. Mettez-le au réfrigérateur pour une utilisation et conservez-le dans une bouteille de réactif brun.
Solution d'application d'iode ({{0}}. 01mol / l): prenez une certaine quantité de solution mère d'iode (0,1 mol / l), diluez-la 10 fois avec de l'eau distillée, mettez-la au réfrigérateur pour une utilisation et conservez-la jusqu'à 1 mois.

② Étapes de fonctionnement expérimental
Prenez la solution enzymatique et diluez-la 10 fois avec une solution saline physiologique, et fonctionnez selon le tableau 5.2. Bien mélanger, la longueur d'onde du spectrophotomètre est de 660 nm et le chemin léger de la tasse colorimétrique est de 10 mm. Zéro avec de l'eau distillée et lire l'absorbance de chaque tube. Calculez l'activité de l'amylase en fonction de la formule de calcul de base 5.3.

 

Tab.5.2 Étapes de fonctionnement de la détermination de l'amylase

 

(3) Détermination de l'activité lipase

La méthode de détermination a été réalisée conformément à QB / T {{0}} [68]. Une solution de test enzymatique à 2% a été préparée avec 0. 0 25 mol / L de tampon phosphate (pH 7,5), la phénolphtaléine a été utilisée comme indicateur et les acides gras ont été titrés avec une solution d'hydroxyde de sodium standard. L'activité lipase a été calculée sur la base du volume d'hydroxyde de sodium consommé dans l'expérience. La règle est: à un pH de 7,5 et une température ambiante de 40 degrés, 1 ml de solution d'enzyme liquide hydrolyse lipase pendant 1 min pour produire 1 μmol d'acide gras, qui est une unité d'activité lipase, exprimée en u / ml. Ensuite, l'activité de la lipase a été calculée selon la formule 5.4: activité enzymatique (U / ml)=(BA) × C / 0,05 × 50 × 1/15 × n=200 / 3 × (ba) × c × n (5.4) où: b est le volume de sodium hydroxyde solution standard, ml; A est le volume de solution standard d'hydroxyde de sodium consommé dans le groupe témoin vierge, ML; C est la concentration de solution standard d'hydroxyde de sodium, mol / L; 0,05 est le facteur de conversion de la concentration de solution standard d'hydroxyde de sodium; 50 est la teneur en acides gras de la solution d'hydroxyde de sodium; 15 min est le temps de réaction; n est la dilution multiple.

(4) Détermination de l'activité de protéase

Reportez-vous à GB / T 23527-2009 [69] avec de légères modifications.
① Préparation de la courbe standard
Prenez 1 ml de solution standard de tyrosine avec différentes concentrations de masse, qui sont 0, 1 0, 20, 30, 40 et 50 mg / L, et ajoutez 5 ml de solution de carbonate de sodium 0,4 mol / L et 1 ml de solution réactive Folin. Réagissez pendant 20 minutes à une température de 40 degrés. Une fois la réaction terminée, retirez la solution de réaction et mesurez la valeur d'absorbance de la solution à une longueur d'onde de 680 nm à l'aide d'un spectrophotomètre. Dessinez une courbe standard de tyrosine avec la concentration de tyrosine comme axe horizontal et valeur d'absorbance comme axe vertical.

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② Détermination de l'activité de la protéase
Groupe expérimental: prendre 1 ml de solution de caséine avec une concentration de 10 g / L et le mélanger uniformément avec 1 ml de la solution d'échantillon à tester, et réagir pendant 10 minutes à une température ambiante de 40 degrés; Filtrez et obtenez le filtrat après la position debout, prenez 1 ml du filtrat, 5 ml de solution de carbonate de sodium et 1 ml de réactif Folin, mélangez uniformément et réagissez pendant 20 minutes à une température ambiante de 40 degrés; Utilisez un spectrophotomètre pour mesurer la valeur d'absorbance de la solution à une longueur d'onde de 680 nm.
Groupe témoin vide: prendre 1 ml de la solution d'échantillon à tester, ajouter de l'acide trichloroacétique, réagir entièrement pour inactiver la protéase, et d'autres méthodes de fonctionnement sont les mêmes que le groupe expérimental.

Calculez l'activité de la protéase selon la formule 5.5:
Activité de protéase (u / ml)=ak × 4/10 (5.5) où: a est l'absorbance de la solution enzymatique dans le groupe expérimental; K est la quantité de tyrosine lorsque l'absorbance est égale à 1; 4 est le volume total de la solution de réaction, ML; 10 est le temps de réaction, min.

(5) Détermination de l'activité de la cellulase [70]

L'activité de la cellulase dans les enzymes est généralement exprimée par la quantité de glucose libérée par une certaine quantité de solution enzymatique par unité de temps. Le principe de l'utilisation de la méthode du papier filtre pour mesurer l'activité de la cellulase est que la cellulase peut décomposer la cellulose dans le papier filtre pour produire des métabolites secondaires tels que le glucose et le glucose peut réagir avec 3, 5- l'acide dinitrosalicylique pour former un complexe jaune. La couleur de cette réaction est relativement brillante, ce qui peut bien déterminer la quantité de glucose et d'autres sucres réducteurs produits.

 

①3, 5- Agent colorimétrique d'acide dinitrosalicylic
Peser avec précision 1 0 g de 3, 5- acide dinitrosalicylic avec un point de fusion de 168-169, le dissoudre avec de l'eau distillée, ajouter 20 g d'hydroxyde de sodium et 200 g de tartrate de sodium de potassium, poursuivre le chauffage jusqu'à ce que le solide soit entièrement dissaillé, dilué à 500ml avec une eau dissouillée, ajoutant la phénolaire, diluée à 500 ml avec une eau dissouée, ajoutant le salin, DILUTE et 500 MA 0,5 g de sulfite de sodium anhydre, remuer en continu pendant le processus d'addition jusqu'à ce qu'il soit complètement dissous, arrête de chauffer après avoir mélangé uniformément, frais à température ambiante, transférer tout sur un ballon volumétrique de 1000 ml, diluer vers la marque avec de l'eau distillée, placer à température ambiante pendant une semaine, filtrer, obtenir le surnageant et stocker dans une bouteille brun.Hydrolyse en enzymatique
Pipette avec précision {{0}}, 0. 5, 1. 0, 1,5, 2,0 ml de solution d'échantillon enzymatique en 2 ml de solution de tampon acétate d'acide acide acétique avec une valeur de pH de 4,5. Après 5 minutes de bain d'eau à température constante à 40 degrés, ajoutez 6 morceaux de papier filtre de chromatographie avec une superficie de 1 × 1 cm2 respectivement et commencez immédiatement le timing pour rendre le temps de réaction précis à 60 minutes. Transférer immédiatement au bain d'eau bouillante pour réaction pendant 10 minutes, et la cellulase perd son activité.

 

 

③ Réaction couleur
Prenez une solution d'échantillon enzymatique, ajoutez 3 ml de 3, 5- Agent colorimétrique d'acide Dinitrosalicylic préparé en ①, chauffer dans un bain d'eau bouillante pendant 15 minutes, retirer, refroidir à température ambiante, ajouter 10 ml d'eau distillée, mélangez uniformément, utiliser le spectrophotomètre à une valeur d'absorbation.
④ Dessin de la courbe standard du glucose
Préparez une solution standard de glucose avec une concentration de 1 mg / ml avec précision et utilisez de l'eau distillée pour fabriquer la solution standard du glucose avec un volume de 0, 0. de 3, 5- agent colorimétrique d'acide dinitrosalicylique préparé en ① pour effectuer une réaction de développement de couleur. Tracez la courbe standard avec une concentration de glucose comme axe horizontal et absorbance comme axe vertical.
Calcul
Utilisez la valeur d'absorbance A après le développement de la couleur avec une solution enzymatique, puis calculez la quantité de libération de glucose m en fonction de la courbe standard du glucose et calculez selon la formule 5.6:
Activité de cellulase (u / ml)=m / (t · m) (5.6) où: m est la quantité de libération de glucose, ug; T est le temps d'hydrolyse enzymatique, Min; M est la teneur en enzyme dans la réaction, UG / ML.