L'extrait de Cistanche Deserticola augmente la formation osseuse dans les ostéoblastes
Mar 05, 2022
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Te-Mao Lia, Hsin-Chih Huangb, Chen-Ming Suc, Tin-Yun Hoa, Chi-Ming Wua, Wen Chi Chend, Yi-Chin Fonga,eet Chih-Hsin Tangf,c
Résumé
Objectifs:Nous avons étudié l'effet deCistanche deserticola Ma. (CD) sur la formation osseuse par des ostéoblastes cultivés.MéthodesLe test de formation de nodules minéralisés a été utilisé pour examiner les effets in vitro du CD sur la formation osseuse. L'expression de l'ARNm de la phosphatase alcaline (ALP), des protéines morphogénétiques osseuses (BMP) -2 et de l'ostéopontine (OPN) a été analysée par réaction quantitative en chaîne par polymérase en temps réel. Le mécanisme d'action de l'extrait de CD a été étudié par Western blot. L'effet anti-ostéoporotique in vivo de l'extrait de CD a été évalué chez des souris ovariectomisées.Principales conclusionsL'extrait de CD n'a eu aucun effet sur la prolifération, la migration ou la cicatrisation des ostéoblastes cultivés, mais a augmenté l'ALP, la BMP -2 et l'ARNm OPN et la minéralisation osseuse. Les inhibiteurs de la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK) ou du facteur nucléaire (NF)-kB ont réduit la formation osseuse induite par l'extrait de CD et l'expression de l'ALP, de la BMP-2 et de l'OPN. Cependant, l'extrait de CD n'a pas affecté l'ostéoclastogenèse. De plus, l'extrait de CD prévient la perte osseuse induite par l'ovariectomie in vivo.conclusionLe CD peut être un nouvel agent de formation osseuse pour le traitement de l'ostéoporose.
Introduction
L'os est un tissu complexe composé de plusieurs types de cellules qui subissent un processus continu de renouvellement et de réparation appelé « remodelage osseux ». Deux principaux types de cellules responsables du remodelage osseux sont les ostéoclastes, qui résorbent l'os, et les ostéoblastes, qui forment de l'os nouveau. Le remodelage osseux est régulé par plusieurs hormones systémiques (par exemple, l'hormone parathyroïdienne, la 1, 25-hydroxyvitamine D3, les hormones sexuelles et la calcitonine) et des facteurs locaux (par exemple, l'oxyde nitrique, les prostaglandines, les facteurs de croissance et les cytokines).[1]
L'ostéoporose survient lorsque la résorption et la formation osseuse ne sont pas coordonnées et que la dégradation osseuse excessive dépasse la formation osseuse.[2] Les traitements actuels de l'ostéoporose comprennent les bisphosphonates, la calcitonine et les œstrogènes, qui sont des inhibiteurs de la résorption osseuse qui maintiennent la masse osseuse en inhibant l'activité des ostéoclastes.[3] Cependant, l'effet de ces médicaments sur l'augmentation ou la récupération de la masse osseuse est relativement faible, certainement pas plus de 2 % par an.[3] Il existe donc un besoin d'agents de construction osseuse, tels que le tériparatide, qui stimulent la formation de nouveaux os et corrigent le changement de la microarchitecture trabéculaire caractéristique de l'ostéoporose établie. [4,5] Parce que la formation de nouveaux os est principalement une fonction de les ostéoblastes, des agents qui agissent soit en augmentant la prolifération des cellules de la lignée ostéoblastique, soit en induisant la différenciation des ostéoblastes, peuvent favoriser la formation osseuse.[5,6]
Bien que les mécanismes de l'ostéoporose restent flous, ils sont probablement liés à la diminution de la disponibilité ou des effets des facteurs de croissance osseuse, tels que les protéines morphogénétiques osseuses (BMP).[7] Les BMP, qui sont structurellement apparentés à la superfamille du facteur de croissance trans-b, ont été identifiés à l'origine par leur capacité à induire la formation d'os ectopique chez les rongeurs.[8] Les BMP jouent un rôle important dans la formation osseuse et la différenciation des cellules osseuses en stimulant l'activité de la phosphatase alcaline (ALP) ainsi que la synthèse du protéoglycane, du collagène et de l'ostéopontine (OPN).[9] Une étude récente a trouvé un lien entre l'ostéoporose et des polymorphismes spécifiques dans les gènes BMP-2, ALP et OPN, suggérant qu'ils sont associés au développement de l'ostéoporose.[10]
Cistanche déserticola Ma.(Orobanchaceae; en abrégé CD) est une herbe indigène en Chine et est largement utilisée en médecine traditionnelle comme agent thérapeutique en raison de ses propriétés sédatives, analgésiques et immunostimulantes.[11] Des études pharmacologiques modernes ont montré que les extraits de CD peuvent stimuler l'immunité,[12] piéger les radicaux libres[13] et augmenter l'activité de la superoxyde dismutase.[14] Les agents anti-inflammatoires et antioxydants ont le potentiel de traiter l'ostéoporose en augmentant la formation osseuse et/ou en supprimant la résorption osseuse.[15,16] Cependant, l'effet de la MC sur la fonction des cellules osseuses n'a pas encore été déterminé. Ici, nous rapportons que l'extrait de CD n'a pas affecté la prolifération, la migration ou l'activité de cicatrisation des ostéoblastes en culture, mais a augmenté l'expression de l'ALP, du BMP -2 et de l'OPN et la minéralisation osseuse. En outre, nous montrons que les voies de signalisation de la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK) et du facteur nucléaire (NF)-kB peuvent être impliquées dans l'augmentation de l'expression génique et de la minéralisation osseuse médiée par CD. En revanche, l'extrait de CD n'a pas supprimé l'ostéoclastogenèse in vitro. Notamment, le traitement des souris avec l'extrait de CD a empêché la perte osseuse induite par l'ovariectomie in vivo. Nos données suggèrent donc que le CD peut être utilisé pour stimuler la formation osseuse pour le traitement de l'ostéoporose.
Cistanche désertique
Matériaux et méthodes
Extrait et matériaux de Cistanche deserticola
L'extrait de CD a été acheté auprès de Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Taiwan). L'extraction et l'isolement de CD ont été suivis comme décrit précédemment (sur la base de données spectrales, ils ont identifié la composition chimique, y compris le bêta-sitostérol, le daucostérol, l'acide succinique, le triacontanol, l'actéoside, la bétaïne et le polysaccharide).[17] Des anticorps polyclonaux de lapin spécifiques des kinases régulées par le signal extracellulaire p (ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun N-terminal kinases (JNK), JNK, p-p65 et p65 ont été achetés auprès de Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, États-Unis). Le kit ELISA d'ostéocalcine a été acheté chez Biosource Technology (Nivelles, Belgique). Les télopeptides C-terminaux du kit ELISA collagène de type I ont été obtenus auprès de Cross Laps (Herlev, Danemark). Le mutant p38 dominant négatif a été fourni par le Dr J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, USA). Le mutant JNK dominant négatif a été fourni par le Dr M. Karin (Université de Californie, San Diego, États-Unis). Le mutant ERK2 dominant négatif a été fourni par le Dr M. Cobb (South-Western Medical Center). Tous les autres réactifs ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich (St Louis, USA).
Culture de cellules
La lignée cellulaire d'ostéoblastes murins MC3T3-E1 a été achetée auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC ; Rockville, États-Unis). Les cellules ont été cultivées dans 95 % d'air, 5 % de CO2 avec a-MEM complété par 20 mm d'HEPES et 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, 2 mm de glutamine, de pénicilline (100 U/ml) et de streptomycine (100 mg /ml).
Mesure de la formation de nodules minéralisés
La formation de nodules minéralisés a été évaluée comme décrit.[18] En bref, les ostéoblastes ont été cultivés dans un milieu contenant de la vitamine C (50 mg/ml) et du b-glycérophosphate (10 mm) pendant deux semaines, et le milieu a été changé tous les trois jours. Après incubation avec un extrait de CD pendant 12 jours, les cellules ont été lavées deux fois avec une solution saline tamponnée au Tris de 20 mm contenant
0.15 m de NaCl (pH 7,4), fixé dans de l'éthanol à 75 % (v/v) glacé pendant 30 min et séché à l'air. Le dépôt de calcium a été déterminé à l'aide d'une coloration au rouge d'alizarine-S. En bref, les cellules et la matrice fixées à l'éthanol ont été colorées pendant 1 h avec 40 mm de rouge d'alizarine-S (pH 4,2) et rincées abondamment à l'eau. La tache liée a été éluée avec du chlorure de cétylpyridinium à 10 % (p/v) et le rouge-S d'alizarine dans les échantillons a été quantifié en mesurant l'absorbance à 550 nm et comparé à une courbe standard. Une mole de rouge d'alizarine-S lie sélectivement environ deux moles de calcium.
Réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel
L'ARN total a été extrait des ostéoblastes à l'aide d'un kit TRIzol (MDBio Inc., Taipei, Taiwan). La transcription inverse a été réalisée à l'aide de 2 mg d'ARN total et d'une amorce oligo (dT).[19,20] La réaction quantitative en chaîne par polymérase en temps réel (qPCR) a été réalisée à l'aide du mélange maître PCR en une étape TaqMan® (Applied Biosystems, Carlsbad, ETATS-UNIS). L'ADNc total a été ajouté (100 ng par 25- ml de réaction) avec des amorces spécifiques à la séquence et des sondes Taqman®. Toutes les amorces et sondes de gène cible ont été achetées dans le commerce, y compris la b-actine comme contrôle interne (Applied Biosystems). Les tests qPCR ont été réalisés en triple exemplaire sur un système de détection de séquence StepOnePlus (Applied Biosystems). Les conditions de cycle étaient l'activation de la polymérase 10-min à 95 degrés suivie de 40 cycles de 95 degrés pendant 15 s et de 60 degrés pendant 60 s. Le seuil a été fixé au-dessus du fond de contrôle sans matrice et dans la phase linéaire de l'amplification du gène cible pour calculer le nombre de cycles au cours desquels le transcrit a été détecté (noté CT).
Analyse Western blot
Les lysats cellulaires ont été préparés comme décrit précédemment. [21,22] Les protéines ont été résolues par SDS-PAGE et transférées sur des membranes de difluorure de polyvinyle Immobilon (Millipore, Billerica, USA). Les transferts ont été bloqués avec de l'albumine de sérum bovin à 4 % pendant 1 h à température ambiante, puis sondés avec des anticorps anti-humains de lapin contre p-65 ou p-p65 (1 : 1000) pendant 1 h à température ambiante. Après trois lavages, les blots ont été incubés avec un anticorps secondaire anti-lapin d'âne conjugué à la peroxydase (1: 1000) pendant 1 h à température ambiante. Les transferts ont été visualisés par chimioluminescence améliorée à l'aide d'un film X-OMAT LS (Eastman Kodak, Rochester, USA).
Ostéoporose induite par l'ovariectomie
Des souris ICR femelles, âgées de quatre semaines, 22 ~ 28 g, ont été utilisées pour cette étude. Les souris ont été ovariectomisées bilatéralement sous anesthésie au trichloroacétaldéhyde (100 mg/kg) et les souris témoins ont été opérées de manière fictive (Sham) à des fins de comparaison. La densité minérale osseuse et le contenu minéral osseux ont été mesurés après administration orale de diverses concentrations d'extraits de CD tous les deux jours pendant quatre semaines. La densité minérale osseuse totale du corps et la teneur en minéraux osseux ont été déterminées par un absorptiomètre à rayons X à double énergie (DEXA ; XR-26 ; Norland, Fort Atkinson, États-Unis) en utilisant un mode pour les petits sujets comme décrit précédemment.[18, 23] Tous les protocoles étaient conformes aux directives institutionnelles et ont été approuvés par le Comité de protection des animaux de l'Université médicale de Chine.
analyses statistiques
L'analyse statistique a été effectuée à l'aide du logiciel Prism 4.01. (GraphPad Software Inc., San Diego, États-Unis). Les valeurs données sont moyennes ± SEM. L'analyse statistique entre deux échantillons a été réalisée à l'aide du test t de Student. Des comparaisons statistiques de plus de deux groupes ont été réalisées à l'aide d'une analyse de variance unidirectionnelle avec le test posthoc de Bonfer-Roni. Dans tous les cas, P < 0,05="" était="" considéré="" comme="">
Extrait de Cistanche désertique
Résultats
L'extrait de Cistanche deserticola augmente la minéralisation osseuse par les ostéoblastes
L'ajout de l'extrait de CD pendant 24 ou 48 h n'a pas affecté la prolifération des cellules ostéoblastes de souris MC3T 3- E1 dans un test MTT (données non présentées). La différenciation des ostéoblastes étant un processus complexe impliquant la prolifération et la migration cellulaires, nous avons également testé la capacité migratoire des cellules MC3T3-E1 après traitement avec l'extrait de CD. En utilisant Transwell et des tests de cicatrisation, nous avons constaté que l'extrait de CD n'affectait pas la migration des ostéoblastes (données non présentées). La formation de nodules minéralisés est l'un des marqueurs de la maturation des ostéoblastes. La coloration au rouge d'alizarine S a montré que des nodules minéralisés se formaient lorsque les ostéoblastes étaient cultivés pendant deux semaines dans un milieu contenant de la vitamine C (50 mg/ml) et du b-glycérophosphate (10 mm), et cela augmentait de manière concentration-dépendante par l'ajout de CD (Figure 1a). Par conséquent, l'extrait de CD a induit la formation de nodules osseux par les ostéoblastes cultivés, mais pas leur prolifération ou leur migration. Nous avons également examiné le rôle de l'extrait de CD dans l'ostéoclastogenèse induite par RANKL mais n'avons trouvé aucun effet (données non présentées).
L'extrait de Cistanche deserticola augmente la phosphatase alcaline, la protéine morphogénétique osseuse -2 et l'expression de l'ostéopontine dans les ostéoblastes en culture
Les ostéoblastes différenciés présentent une activité ALP élevée, qui est en corrélation avec des niveaux élevés d'expression enzymatique.[18] Nous avons constaté que le traitement avec un extrait de CD pendant 72 h augmentait de manière significative l'activité ALP des ostéoblastes (Figure 1b). Compte tenu du rôle crucial de BMP-2, ALP et OPN dans la différenciation des ostéoblastes, nous avons testé si l'extrait de CD exerce son effet sur la différenciation des ostéoblastes en régulant l'expression de BMP-2, ALP et OPN. Le traitement des cellules avec l'extrait de CD a augmenté l'expression de l'ARNm de l'ALP, du BMP -2 et de l'OPN d'une manière dépendante de la concentration (Figure 1c), démontrant que l'extrait de CD a induit la différenciation des ostéoblastes en régulant positivement l'ALP, le BMP -2 et l'expression OPN.
L'extrait de Cistanche deserticola augmente la formation de nodules osseux par la voie de la protéine kinase activée par les mitogènes
Il a été rapporté que MAPK joue un rôle important dans la formation osseuse [24, 25], nous avons donc ensuite examiné si cette voie de signalisation est impliquée dans la minéralisation osseuse induite par l'extrait de CD. Le prétraitement des cellules avec l'inhibiteur ERK U0126, l'inhibiteur p38 SB203580 ou l'inhibiteur JNK SP600125 a réduit la minéralisation osseuse accrue par l'extrait de CD (figures 2a, 3a et 4a). De plus, les inhibiteurs ont également bloqué l'expression de l'ALP, de la BMP -2 et de l'OPN induite par l'extrait de CD (figures 2b à 4c). La transfection de cellules avec le mutant ERK2, p38 ou JNK a réduit l'augmentation de l'extrait de CD dans l'expression de l'ARNm ALP, BMP -2 et OPN (figures 2c, 3c et 4c). Ensuite, nous avons directement examiné l'activation de ERK, p38 et JNK après le traitement de l'extrait de CD. L'incubation de cellules avec l'extrait de CD a induit la phosphorylation de ERK, p38 et JNK (figures 2d, 3d et 4d). Par conséquent, ERK, p38 et JNK interviennent dans l'augmentation de la formation osseuse induite par le traitement CD des ostéoblastes.
L'extrait de Cistanche deserticola augmente la formation de nodules osseux par la voie du facteur nucléaire-kB
Comme mentionné précédemment, l'activation de NF-kB est nécessaire à la formation osseuse. [26,27] Nous avons ensuite traité les ostéoblastes avec les inhibiteurs de NF-kB, le pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC) et la N-tosyl-L-phénylalanine chlorométhyl cétone (TPCK). Calbiochem (Darmstadt, Allemagne) pour déterminer si l'activation de NF-kB est impliquée dans la minéralisation osseuse induite par l'extrait de CD. La figure 5a montre que le prétraitement des ostéoblastes avec PDTC ou TPCK a inhibé la formation de nodules osseux induite par l'extrait de CD et a également réduit l'augmentation de l'expression de l'ALP, du BMP-2 et de l'OPN (Figures 5b et 5c). La phosphorylation de la sous-unité NF-kB p65 est un indicateur de l'activation de NF-kB ; [28] conformément à cela, nous avons constaté que l'extrait de CD augmentait la phosphorylation de p65 dans les ostéoblastes (Figure 5d). Ces résultats indiquent que l'activation de NF-kB est importante pour l'expression de l'ALP, de la BMP-2 et de l'OPN induite par l'extrait de CD et la formation de nodules osseux.
Inhibition de la perte osseuse par l'extrait de Cistanche deserticola chez les souris ovariectomisées
Pour examiner l'effet de l'extrait de CD sur la perte osseuse, l'ostéoporose a été induite chez des souris femelles par ovariectomie. Comme prévu, les souris ovariectomisées ont présenté une diminution de la densité minérale osseuse totale du corps et de la teneur en minéraux osseux (figures 6a et 6b). Le traitement avec l'extrait de CD pendant quatre semaines a inhibé la perte de densité minérale osseuse et de contenu minéral osseux de manière dose-dépendante (Figure 6a et 6b). Les concentrations sanguines d'ALP peuvent refléter l'activité ostéoblastique.[29] Comme le montre la figure 6c, l'extrait de CD a inhibé la diminution de l'activité ALP sérique induite par l'ovariectomie. De plus, l'extrait de CD a également augmenté le niveau d'ostéocalcine, un marqueur de la formation osseuse, et réduit le niveau de télopeptides C-terminaux du collagène de type I, un marqueur de la résorption osseuse (Figures 6d et 6e). Ces résultats confirment ainsi la puissance et l'efficacité de l'extrait de CD dans la prévention de la perte osseuse in vivo.
Discussion
Cistanche désertiqueMa, une herbe indigène en Chine, est largement utilisée en médecine traditionnelle pour divers traitements thérapeutiques en raison de son activité sédative, analgésique et immunostimulante. n'affecte pas leur migration ou leur prolifération cellulaire. De plus, nous avons découvert que ALP, BMP-2 et OPN sont des protéines cibles de la signalisation induite par l'extrait de CD, qui nécessite l'activation de ERK, p38, JNK et NF-kB.
L'os est un tissu complexe composé de plusieurs types de cellules qui subissent en permanence un processus de renouvellement et de réparation.[30] Lorsque la résorption et la formation osseuse sont déséquilibrées, la dégradation osseuse l'emporte sur la formation osseuse et l'ostéoporose en résulte.[30] Nous avons utilisé des souris ovariectomisées pour examiner l'effet anti-ostéoporotique de l'extrait de CD. Les souris ovariectomisées avaient une densité minérale osseuse corporelle totale réduite et une teneur minérale osseuse réduite, ce qui a été atténué par un traitement avec un extrait de CD. L'extrait de CD a également augmenté les taux sériques du marqueur ostéogénique ALP et de l'ostéocalcine. Par conséquent, le CD est un agent de formation osseuse qui empêche la perte osseuse provoquée par l'ovariectomie in vivo.
Bien que les mécanismes de l'ostéoporose ne soient pas entièrement clairs, ils sont probablement liés à la diminution de la disponibilité, ou à la diminution des effets, des facteurs de croissance osseuse, tels que l'ALP, le BMP-2 et l'OPN. Ces trois facteurs jouent un rôle important dans le processus de formation et de remodelage osseux[31] et il a été bien documenté que la stimulation de la différenciation des cellules ostéoblastiques se caractérise principalement par une expression accrue de l'ALP, du BMP-2 et de l'OPN[32]. ] Dans cette étude, nous avons constaté que l'extrait de CD augmentait l'expression de l'ALP, de la BMP-2 et de l'OPN et augmentait la minéralisation osseuse. Par conséquent, l'extrait de CD médie la formation osseuse en partie en régulant à la hausse l'expression de l'ALP, du BMP -2 et de l'OPN.
Il a été rapporté que p38 est impliqué dans la régulation de l'expression de l'ALP lors de la différenciation des cellules ostéoblastiques ; [33] de même, ERK1/2 est important pour la prolifération et la différenciation des ostéoblastes. [34,35] JNK est impliqué dans la formation des ostéoclastes. .[36] Nous avons montré ici que l'extrait de CD induisait la phosphorylation de ERK, p38 et JNK, et que les inhibiteurs de ces enzymes antagonisaient la potentialisation de la minéralisation osseuse médiée par l'extrait de CD, suggérant que l'activation de ERK, p38 et JNK joue un rôle obligatoire dans la formation osseuse induite par l'extrait de CD par ostéoblastes. De plus, les inhibiteurs enzymatiques et les mutants dominants négatifs de ERK, p38 et JNK ont réduit l'expression de l'ALP, de la BMP -2 et de l'OPN améliorée par l'extrait de CD. Ces données suggèrent que l'activation des voies ERK, p38 et JNK est nécessaire pour l'augmentation de l'expression et de la maturation de l'ALP, du BMP-2 et de l'OPN causée par l'extrait de CD dans les ostéoblastes. Il a été rapporté que l'ERK augmentait la prolifération et la différenciation des ostéoblastes.[34,35] Cependant, nous n'avons pas détecté d'effet de l'extrait de CD sur la prolifération des ostéoblastes. Par conséquent, d'autres voies peuvent avoir contrecarré l'effet ERK après la stimulation de l'extrait de CD ou être nécessaires à la prolifération. À cet égard, nous avons constaté que les inhibiteurs de PI3K et d'Akt réduisent également la minéralisation osseuse induite par l'extrait de CD et l'expression de l'ARNm de l'ALP, de la BMP -2 ou de l'OPN (données non présentées). Par conséquent, ces voies peuvent être nécessaires pour la formation osseuse induite par l'extrait de CD.
Il a été démontré que le NF-kB contrôle la fonction des ostéoblastes dans l'os.[37] Les résultats de cette étude montrent que l'activation de NF-kB contribue à la minéralisation osseuse induite par l'extrait de CD et à l'expression de l'ALP, de la BMP-2 et de l'OPN dans les ostéoblastes en culture et que les inhibiteurs de la voie de signalisation dépendante de NF-kB (PDTC et TPCK ) a inhibé la minéralisation osseuse induite par l'extrait de CD et l'expression de l'ALP, de la BMP-2 et de l'OPN. p65 est phosphorylé à Ser536 par une variété de kinases dans plusieurs voies de signalisation, ce qui améliore le potentiel de transactivation de p65.[38] Les résultats de cette étude ont montré que l'extrait de CD augmentait la phosphorylation de p65. Pris ensemble, ces résultats suggèrent que l'activation de NF-kB est nécessaire pour la formation osseuse induite par l'extrait de CD dans les ostéoblastes en culture. Nous avons également constaté que les inhibiteurs de ERK, p38 et JNK inversaient l'activité de la luciférase NF-kB induite par l'extrait de CD (données non présentées), ce qui correspond au fait que ces enzymes sont des médiateurs en amont de l'activation de NF-kB induite par l'extrait de CD. Par conséquent, l'extrait de CD induit la formation osseuse par les voies ERK/p38/JNK/ et NF-kB.
conclusion
Cette étude a démontré que l'extrait de CD induit la différenciation et la maturation des ostéoblastes mais pas la prolifération ou la migration. L'extrait de CD a également augmenté l'expression d'ALP, de BMP-2 et d'OPN et la minéralisation osseuse. Nous avons montré que les voies ERK, p38, JNK et NF-kB sont impliquées dans la formation osseuse médiée par l'extrait de CD et l'expression de ALP, BMP-2 et OPN. De plus, l'extrait de CD a empêché la perte osseuse in vivo induite par l'ovariectomie. Par conséquent, le CD peut être bénéfique pour stimuler la formation osseuse dans le traitement des maladies ostéoporotiques.
