Partie 1 : L'échinacoside inhibe la libération de glutamate en supprimant l'entrée de Ca2 plus dépendante de la tension et la protéine kinase C dans les terminaisons nerveuses cérébrocorticales du rat

Contact : Audrey Hu Whatsapp/hp : 0086 13880143964 E-mail :audrey.hu@wecistanche.com

Cheng Wei Lu 1,2, Tzu Yu Lin 1,2, Shu Kuei Huang 1 et Su Jane Wang 3,*

Résumé:

Le système glutamatergique peut être impliqué dans les effets des thérapies neuroprotectrices.Échinacoside, un glycoside phényléthanoïde extrait de l'herbe médicinale chinoiseHerba Cistanche, a des effets neuroprotecteurs. Cette étude a étudié les effets deéchinacosidesur la libération de glutamate induite par l'4-aminopyridine dans les terminaisons nerveuses cérébrocorticales du rat (synaptosomes). L'échinacoside a inhibé la libération de glutamate induite par l'4-aminopyridine, dépendante du Ca2 plus, mais pas indépendante du Ca2 plus, d'une manière dépendante de la concentration. L'échinacoside a également réduit l'augmentation induite par l'4-aminopyridine de la concentration de Ca2 plus libre dans le cytoplasme, mais n'a pas modifié le potentiel de membrane synaptosomale. L'effet inhibiteur de l'échinacoside sur la libération de glutamate induite par l'4-aminopyridine a été empêché par l'o-conotoxine MVIIC, un bloqueur à large spectre des canaux Cav2.2 (type N) et Cav2.1 (type P/Q). , mais était insensible au Ca2 intracellulaire plus les inhibiteurs de libération dantrolène et 7-chloro-5-(2-chlorophényl)-1,5-dihydro-4 ,1-benzodiazépine-2(3H)-one (CGP37157). De plus, l'échinacoside a diminué la phosphorylation induite par l'4-aminopyridine de la protéine kinase C, et les inhibiteurs de la protéine kinase C ont aboli l'effet de l'échinacoside sur la libération de glutamate. D'après ces résultats, nous suggérons que l'effet inhibiteur de l'échinacoside sur la libération de glutamate évoquée est associé à une réduction de l'entrée de Ca2 plus dépendant de la tension et à la suppression subséquente de l'activité de la protéine kinase C.

Mots clés:échinacoside; libération de glutamate ; les terminaisons nerveuses cérébrocorticales ; canaux Ca2 plus dépendants de la tension ; protéine kinase C

1. Introduction

Échinacosideest un glycoside phényléthanoïde majeur présent dansHerbeCistanche, une médecine traditionnelle chinoise bien connue utilisée pour traiter l'oubli, l'impuissance et la constipation chronique [1].Échinacosidepossède diverses bioactivités telles que l'antioxydation, l'anti-inflammation, l'anticancéreux, l'hépatoprotection et la modulation immunitaire [2–4]. Notamment, l'échinacoside a des effets neuroprotecteurs ; par exemple, il peut protéger contre le stress oxydatif ou la neurotoxicité induite par la neurotoxine dans les neurones corticaux primaires de rat, les cellules de neuroblastome humain SH-SY5Y et les cellules de phéochromocytome (PC12) [5–8]. De plus, l'échinacoside atténue les lésions cérébrales et améliore la fonction cognitive dans les modèles animaux de la maladie de Parkinson, de la maladie d'Alzheimer et de l'occlusion de l'artère cérébrale moyenne [9–12]. Cependant, le mécanisme par lequeléchinacosideinduit une neuroprotection n'est pas entièrement comprise.

La neuroprotection est un processus complexe de préservation de la structure et de la fonction neuronales lors d'agressions toxiques. La réduction de l'excitotoxicité du glutamate est considérée comme un mécanisme potentiel impliqué dans la neuroprotection cérébrale. Le glutamate, un neurotransmetteur d'acide aminé excitateur, a un rôle crucial dans plusieurs fonctions cérébrales [13]. Cependant, la suractivation des récepteurs du glutamate sous des concentrations élevées de glutamate provoque une surcharge intracellulaire de Ca2 plus, un dysfonctionnement mitochondrial, la production de radicaux libres et la mort neuronale [14,15]. Ce processus pathologique est impliqué dans de nombreux troubles cérébraux, notamment l'ischémie cérébrale, les lésions cérébrales traumatiques, l'épilepsie et les maladies neurodégénératives [16,17]. Par conséquent, les inhibiteurs bloquant la transmission glutamatergique physiopathologique sont considérés comme des médicaments neuroprotecteurs potentiels. Des exemples notables de ceux-ci sont les antagonistes des récepteurs du glutamate [18,19] ; cependant, les essais cliniques de ces médicaments ont échoué en raison d'une efficacité moindre et d'effets secondaires indésirables, voire cytotoxiques [20,21]. En plus du blocage direct des récepteurs du glutamate, l'inhibition de la libération du glutamate peut être une stratégie efficace de neuroprotection. Plusieurs neuroprotecteurs (par exemple, la mémantine et le riluzole) peuvent réduire la libération de glutamate dans les tissus cérébraux du rat [22-24].

Considérant le rôle du glutamate dans l'excitotoxicité et le profil neuroprotecteur de l'échinacoside, la présente étude a utilisé des terminaisons nerveuses isolées (synaptosomes) purifiées du cortex cérébral de rat pour étudier l'effet de l'échinacoside sur la libération de glutamate et explorer plus avant les mécanismes potentiels. La préparation terminale nerveuse isolée est un modèle bien établi pour étudier la régulation présynaptique de la libération de neurotransmetteurs par des médicaments en l'absence d'effets postsynaptiques [25]. En utilisant ce modèle, nous avons évalué l'effet de l'échinacoside sur la libération de glutamate, le potentiel membranaire, l'influx présynaptique de Ca2 plus et l'activité de la protéine kinase C. Selon notre revue de la littérature, il s'agit du premier rapport documentant le mécanisme par lequel l'échinacoside inhibe la libération de glutamate endogène au niveau présynaptique.

2. Résultats

2.1. ÉchinacosideInhibe la libération de 4- glutamate provoquée par l'aminopyridine par les terminaisons nerveuses cérébrocorticales du rat en réduisant l'exocytose vésiculaire

La figure 1 illustre l'effet dépendant de la concentration de l'échinacoside sur la libération de glutamate induite par l'4-aminopyridine à partir de synaptosomes cérébrocorticaux de rat purifiés. Dans les synaptosomes incubés avec du CaCl2 1 mM, l'4-aminopyridine 1 mM a provoqué une libération de glutamate de 7,4 ± {{1{{20}}}}.1 nmol/mg/5 min, qui a été réduite par 1, 5, 10, 30 et 50 uM d'échinacoside à 6,5 ± 0,2, 5,8 ± 0,3, 4,8 ± 0,2,

4,1 ± 0.1, ou 2,3 ​​± 0.4 nmol/mg/5 min, respectivement (F(5,24)=67.1, p=0. 000). La valeur IC50 pour l'inhibition médiée par l'échinacoside de la libération de glutamate induite par l'4-aminopyridine, dérivée d'une courbe dose-réponse, était de 24 uM. De plus, la libération de glutamate évoquée par 1 mM d'4-aminopyridine dans une solution extracellulaire sans Ca2 plus contenant 300 uM d'éthylène glycol bis(-aminoéthyléther)-N,N,N/,N/-acide tétraacétique (EGTA) était de 2,1 0,2 nmol/mg/5 min (F(2,12)=310,65, p=0.000),

et ce composant indépendant de Ca2 plus de la libération de glutamate évoquée par l'4-aminopyridine n'a pas été affecté par 20 uM d'échinacoside (1,8 ± 0.2 nmol/mg/5 min ; p {{1 0}}.58 ; Figure 1). Dans les synaptosomes traités avec la 0.1 uM de bafilomycine A1, un inhibiteur du transporteur vésiculaire [26], la libération de glutamate évoquée par la 4-aminopyridine a été significativement réduite (2,2 ± 0.2 nmol/mg/ 5 min ; F (2,12)=249.518, p=0.000). En présence de bafilomycine A1, 20 uM d'échinacoside n'ont pas réussi à inhiber de manière significative la libération de glutamate (2,1 ± 0,2 nmol/mg/5 min ; p=0.94 ; Figure 1). En revanche, 10 uM de DL-thréo-bêta-benzyl-oxyaspartate (DL-TBOA, un inhibiteur de la recapture du glutamate) [27], ont augmenté la libération de glutamate évoquée par 4-aminopyridine à 11,8 ± 0,4 nmol/mg/5 min ( t(8)=-11.31, p=0.000). Même en présence de DL-TBOA, l'échinacoside 20 uM a inhibé de manière significative la libération de glutamate induite par l'4-aminopyridine (7,7 ± 0,2 nmol/mg/5 min ; F(2,12)=87.23, p=0.000 ; Figure 1).

2.2 L'échinacoside réduit la concentration cytosolique de Ca2 plus mais n'altère pas le potentiel de membrane synaptosomale

La dépolarisation des synaptosomes causée par 1 mM d'4-aminopyridine a augmenté la concentration de Ca2 plus (p=0.000 ; tableau 1). L'application de 20 uM d'échinacoside n'a pas significativement affecté la concentration basale de Ca2 plus (t(8)=0.06, p=0.95) mais a significativement réduit l'augmentation induite par l'4-aminopyridine dans Ca2 plus concentration (t(10)=6.16, p=0.000). De plus, la 4-aminopyridine 1 mM a augmenté dans la fluorescence de l'iodure de 3',3',3'-dipropylthiadicarbocyanine [DiSC3(5)] (p=0.000). L'ajout de 20 uM d'échinacoside n'a pas modifié le potentiel de membrane au repos (t(8)=0.976, p=0.36) ni modifié de manière significative l'augmentation médiée par 4-aminopyridine de DiSC3 (5) fluorescence (t(8)=-0.014, p=0.99 ; tableau 1).

2.3 La réduction de l'afflux de Ca2 plus par les canaux Cav2.2 (type N) et Cav2.1 (type P/Q) peut être associée à l'inhibition de la 4-libération de glutamate provoquée par l'aminopyridine par l'échinacoside

La figure 2 montre que 2 uM d'o-conotoxine MVIIC, un bloqueur de canaux Ca2 plus de type N et P/Q, a réduit la libération de glutamate évoquée par 4-aminopyridine de 7,4 ± {{10}}. 2 à 2.0 ± 0.1 nmol/mg/5 min (t(9)=25.35, p=0.000). En présence d'o-conotoxine MVIIC, l'effet de l'échinacoside 20 uM sur la libération de glutamate induite par l'4-aminopyridine n'était pas significatif (1,8 2± plus 0,2 nmol/mg/5 min ; t(8)=1.06,p=0.32). Le dantrolène (10 uM), un inhibiteur de la libération intracellulaire de Ca à partir de l'endoplasme

réticulum [28], réduction de la libération de glutamate induite par l'4-aminopyridine (5,6 ± 0.3 nmol/mg/5 min ; F(2,14) {{10}}. 95, p=0.000). Cependant, en présence de dantrolène, l'échinacoside 20 uM pourrait encore inhiber significativement la libération de glutamate (3,3 ± 0,2 nmol/mg/5 min ; p=0.000). Des résultats similaires ont été observés avec 100 uM de 7-chloro-5-(2-chlorophénie)-1,5-dihydro-4,1-benzothiazépine -2(3H)-one (CGP37157), un bloqueur perméable à la membrane de l'échange mitochondrial Na plus /Ca2 plus. Dans les cinq préparations synaptosomales examinées, 20 uM d'échinacoside combinés à 100 uM de CGP37157 ont réduit la libération de glutamate induite par l'4-aminopyridine de 48,3 % ± 5,2 % (F(2,13) ​​= 136.79, p {{ 49}}.000), similaire à l'inhibition par l'échinacoside seul (46,2 % ± 2,3 % ; p=0.89 ; Figure 2).

2.4 ÉchinacosideInhibe la 4-libération de glutamate évoquée par l'aminopyridine en signalant via la protéine kinase C

Comme illustré à la figure 3, 10 uM 2-[1-(3-diméthylaminopropyl)indol-3-yl]-3-(indol-3-yl) maléimide (GF109203X), un inhibiteur général de la protéine kinase C [29], a réduit la libération de glutamate induite par l'4-aminopyridine (F(2,13) ​​= 19.46, p=0.{{17 }}). Dans les synaptosomes traités au GF109203X, l'échinacoside 20 uM a réduit la libération de glutamate induite par l'4-aminopyridine de seulement 5,5 % ± 1,8 % (p=0.89), moins que l'échinacoside seul (42,4 % ± 2,3 pour cent ; p=0.000). Des résultats similaires ont été obtenus avec le 5,6,7,13-tétrahydro-13-méthyl-5-oxo-12H-indolo[2,3-a]pyrrolo[3 ,4-c]carbazole-12-propanenitrile (Go6976), un sélectif des isoformes de la protéine kinase C Ca2 plus dépendante ( , I, II, y) [29]. En présence de 3 uM de Go6976, 20 uM d'échinacoside ont réduit la libération de glutamate de 11,9 % ± 2,9 % (p=0.59), ce qui signifie une réduction significative par rapport à celle de l'échinacoside seul (42,4 % 2,3 % ; p {{ 65}}.000 ; Figure 3). En revanche, la rottlerine 3 uM, un inhibiteur de la protéine kinase C6 indépendant de Ca2 plus [30], n'a pas modifié de manière significative la libération de glutamate induite par l'4-aminopyridine (1 mM) (p=0.45). Néanmoins, en présence de rottlerine, 20 uM d'échinacoside ont effectivement provoqué une inhibition moyenne de 37,1 % ± 5,6 % de la libération (F(2,13) ​​= 19.72, p=0.{{88 }}), similaire à celle de l'échinacoside seul (p=0.41 ; Figure 3). En outre, l'inhibiteur de la protéine kinase activée par un agent mitogène 2-(2-amino-3-méthoxyphényl)-4H-1-benzopyran-4-one) (PD98059 ) (50 uM) et l'inhibiteur de la protéine kinase A N-[2-(p-bromocinnamylamino)éthyl]-5-isoquinolinesulfonamide (H89) (100 uM) ont réduit la libération de glutamate induite par l'4-aminopyridine (p=0.000). Même en présence de PD98059 ou H89, l'échinacoside 20 uM a effectivement réduit la libération (F(2,13) ​​= 52.3, p=0.000 ; Figure 3).

La figure 4 montre que 1 mM 4- aminopyridine a augmenté la phosphorylation de la protéine kinase C dans les synaptosomes (t(4)=-6.871, p=0.002). Lorsque les synaptosomes ont été prétraités avec 20 uM d'échinacoside pendant 10 minutes avant l'ajout de 4-aminopyridine, 4-la phosphorylation induite par l'aminopyridine de la protéine kinase C a considérablement diminué (F(2,6)=29.202 , p=0.001).

2.5 L'inhibition médiée par l'échinacoside de la libération de glutamate n'implique pas un récepteur de l'acide gamma-aminobutyrique de type A (GABAA)

Dans la figure 5, l'effet de l'échinacoside sur la libération de glutamate induite par l'4-aminopyridine en l'absence ou en présence de SR95531 (un antagoniste du récepteur GABAA) a été comparé. De plus, 100 uM de SR95531 n'ont pas modifié de manière significative la libération de glutamate induite par la 4-aminopyridine (1 mM). Dans les synaptosomes traités au SR95531-, l'application de 20 uM d'échinacoside a entraîné une inhibition de 43 % de la libération de glutamate évoquée par 4-aminopyridine (F(2,12)=42.63, p { {18}}.000), qui n'était pas significativement différent de l'inhibition produite par l'échinacoside seul (40 % ; p=0.000). Un résultat similaire a été obtenu avec un autre antagoniste des récepteurs GABAA, la bicuculline (50 uM). La libération mesurée en présence de bicuculline et d'échinacoside était significativement différente de celle obtenue en présence de bicuculline seule (p=0.000).

3. Débat

Dans cette étude,échinacoside, un composé actif dans HerbaCistanche, a inhibé la libération de glutamate induite par l'4-aminopyridine dans les terminaisons nerveuses du cortex cérébral du rat. Les mécanismes sous-jacents possibles de laéchinacoside-médiée par l'inhibition de la libération de glutamate sont étudiées plus en détail et discutées ici.

3.1 Mécanismes sous-jacents à l'inhibition de la libération de glutamate par l'échinacoside

La libération de glutamate évoquée par l'4-aminopyridine comprend deux composants : un composant dépendant du Ca2 plus physiologiquement pertinent, qui est produit par l'exocytose des vésicules synaptiques contenant du glutamate ; et un composant Ca2 plus indépendant, qui provient d'une dépolarisation prolongée provoquant un déplacement médié par le potentiel membranaire de l'état d'équilibre du transporteur de glutamate vers l'extérieur, affectant ainsi l'efflux cytosolique du glutamate [31]. Ici, nous avons observé que l'échinacoside n'inhibait pas significativement la libération de glutamate induite par l'4-aminopyridine en présence d'un milieu sans Ca2 plus (libération indépendante de Ca2 plus). De plus, l'inhibition observée médiée par l'échinacoside de la libération de glutamate induite par l'4-aminopyridine a été efficacement prévenue par la bafilomycine A1 (qui épuise la teneur en glutamate des vésicules synaptiques), mais pas par le DL-TBOA (qui inhibe de manière non sélective tous les acides aminés excitateurs sous-types de transporteurs). Ces résultats suggèrent que l'échinacoside affecte l'exocytose Ca2+-dépendante de la libération de glutamate sans affecter l'efflux cytosolique Ca2+-indépendant du glutamate par l'inversion du transporteur de glutamate de la membrane plasmique terminale nerveuse. Dans les terminaisons synaptiques, l'inhibition du canal Na plus ou l'activation du canal K plus stabilise l'excitabilité membranaire et par conséquent réduit l'entrée évoquée de Ca2 plus et la libération de neurotransmetteurs [32,33]. Par conséquent, le mécanisme potentiel sous-jacent à l'inhibition de la libération de glutamate médiée par l'échinacoside implique une réduction de l'excitabilité synaptosomale. Cependant, cette possibilité est intenable sur la base de deux observations : (1) 4-la dépolarisation du potentiel de membrane induite par l'aminopyridine, mesurée avec le colorant sensible au potentiel de membrane DiSC3(5) n'a pas été affectée par l'ajout d'échinacoside ; et (2) l'échinacoside n'a pas affecté la libération de glutamate indépendante du Ca2 plus induite par l'4-aminopyridine, une composante de la libération qui ne dépend que du potentiel de membrane [31]. Si l'effet n'est pas causé par la suppression de l'excitabilité synaptosomale, il peut se manifester par une réduction de l'activité des canaux Ca2 plus Cav2.2 (type N) et Cav2.1 (type P/Q) couplée à une exocytose du glutamate dans le terminaisons nerveuses [34–36]. En utilisant le fura-2, nous démontrons que l'échinacoside réduit significativement l'augmentation de la concentration de Ca2 plus évoquée par l'4-aminopyridine. De plus, nos données montrent que l'effet inhibiteur de l'échinacoside sur la libération de glutamate évoquée par l'4-aminopyridine est passé de 42,4 % 2,3 % à 12,1 % 3,9 % après exposition à un bloqueur de Cav2.2 (type N) et Cav2. .1 canaux Ca2 plus (type P/Q). De plus, nous avons observé que l'échinacoside continuait à inhiber significativement la libération de glutamate induite par l'4-aminopyridine en présence d'inhibiteurs de libération de Ca2 intracellulaire plus. Ces résultats indiquent que la suppression simultanée de l'activité des canaux Ca2 plus Cav2.2 (type N) et Cav2.1 (type P/Q) est le mécanisme potentiellement sous-jacent à l'inhibition de la libération de glutamate médiée par l'échinacoside. Cependant, l'activation combinée de l'activité des canaux Ca2 plus Cav2.2 (type N) et Cav2.1 (type P/Q) n'a pas pu bloquer complètement l'action de l'échinacoside. Par conséquent, d'autres types non identifiés de canaux Ca2 plus ou d'autres voies présynaptiques peuvent être impliqués dans l'inhibition. Par exemple, les récepteurs GABAA sont présents au niveau présynaptique et il a été démontré que leur activation inhibe l'influx de Ca2 et la libération de glutamate [37]. Dans la présente étude, les antagonistes des récepteurs GABAA SR95531 et la bicuculline n'ont pas bloqué l'inhibition de la libération de glutamate médiée par l'échinacoside, ce qui suggère que les récepteurs GABAA ne sont pas impliqués dans la réduction de l'activité du canal Ca2 plus voltage-dépendant et dans l'inhibition subséquente de la libération de glutamate. L'entrée de Ca2 plus par les canaux Ca2 plus dépendants de la tension active plusieurs protéines kinases associées à la libération de glutamate dans les terminaisons nerveuses, notamment la protéine kinase activée par un mitogène, la protéine kinase C et la protéine kinase A. Ici, nous démontrons que les inhibiteurs de la protéine kinase C antagonisent efficacement l'échinacoside -l'inhibition médiée de la libération de glutamate ; néanmoins, l'inhibiteur de la protéine kinase activée par un mitogène PD98059 ou l'inhibiteur de la protéine kinase A H89 était inefficace. De plus, la phosphorylation de la protéine kinase C induite par l'4-aminopyridine a diminué dans les synaptosomes après un prétraitement avec de l'échinacoside à une concentration efficace pour inhiber la libération de glutamate. Par conséquent, la voie de signalisation de l'inhibition de la libération de glutamate médiée par l'échinacoside peut impliquer la protéine kinase C. La protéine kinase C est un système de signalisation intracellulaire important qui est présent au niveau présynaptique et joue un rôle crucial dans l'exocytose des neurotransmetteurs. Par exemple, plusieurs protéines synaptiques impliquées dans le trafic ou le recrutement et l'exocytose des vésicules synaptiques, comme le substrat myristoylé de la kinase C riche en alanine, sont phosphorylées par la protéine kinase C [38,39]. Ce processus de phosphorylation peut être augmenté par l'entrée de Ca2 plus stimulée par la dépolarisation, ce qui facilite la libération de glutamate [40]. Par conséquent, nous pouvons raisonnablement supposer que l'effet inhibiteur de l'échinacoside sur l'entrée de Ca2 plus observé ici peut réduire l'activité de la protéine kinase C et, par conséquent, la libération de glutamate.

Veuillez cliquer ici pour la partie 2