Méthodes de génétique combinatoire pour découvrir des combinaisons réglementaires d'ordre élevé et concevoir des pilotes génétiques pour la différenciation neuronale

Plonger dans la recherche de facteurs efficaces de différenciation cellulaire

Les chercheurs s'efforcent toujours de trouver de meilleures thérapies pour inverser ou ralentir la progression des troubles neurologiques tels que la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer et la maladie de Huntington. Ces troubles sont le résultat de la mort des cellules neuronales dans différentes parties du cerveau. Les médicaments ou les traitements utilisés pour soulager les symptômes chez les patients n'ont pas été bien établis.

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Ils ne récupèrent pas les tissus nerveux endommagés et peuvent entraîner des effets secondaires indésirables. Par conséquent, un nombre croissant d'études considèrent les cellules souches comme une thérapeutique prometteuse, en raison de leurs capacités d'auto-renouvellement et de leur flexibilité de différenciation en lignées cellulaires souhaitées pour la greffe chez le patient afin de récupérer les tissus neuronaux perdus.

Cependant, avant que les cellules souches puissent être utilisées cliniquement dans le traitement des troubles neurologiques, il reste encore des domaines qui nécessitent une meilleure compréhension pour libérer leur plein potentiel. Les cellules souches sont régénératives et malléables, avec la propension à devenir n'importe quel type de cellule étant donné la bonne concoction de facteurs pour conduire la différenciation. Cependant, il y a une profondeur de complexité dans le vaste réseau de facteurs.

Il est important de déterminer les combinaisons de facteurs de transcription (TF), de petites molécules et/ou de facteurs de croissance pour obtenir la synergie optimale pour différencier les cellules souches, y compris les cellules souches embryonnaires (CSE) et les cellules souches pluripotentes induites au rythme le plus rapide, ce qui entraîne dans la population la plus pure d'une lignée neuronale. Cependant, il pourrait y avoir un moyen stratégique de dépister ces facteurs de manière plus rentable et plus rapide.

Cela aiderait à optimiser les protocoles déjà établis qui sont encore laborieux ou pour une caractérisation plus poussée des sous-types neuronaux tels que les neurones épineux moyens, les neurones sensoriels et les neurones sérotoninergiques. Il reste un défi de dresser un profil complet des moteurs du destin neuronal et de définir comment ces éléments interagissent les uns avec les autres dans le réseau de régulation.

Quelques groupes ont utilisé de nouvelles approches de criblage à haut débit pour élucider le réseau de régulation du destin cellulaire et ont fourni des informations informatives sur les facteurs qui déterminent la conversion neuronale et la survie. Liu et al. (2018) ont utilisé l'activation CRISPR (CRISPRa) pour rechercher des TF ou des facteurs de liaison à l'ADN qui favorisent le destin neuronal des ESC. Cependant, le travail s'est limité à l'étude de facteurs uniques ou de combinaisons par paires.

Un autre dépistage systématique a été réalisé par Tsunemoto et al. (2018), qui ont étudié la relation entre les TF. La plupart de leurs TF simples sélectionnés n'ont montré aucun effet dans l'étude, cependant, ils ont identifié 76 combinaisons de TF par paires pour favoriser la différenciation des fibroblastes de souris en neurones induits.

Notamment, leurs résultats manquaient de cohérence avec les études précédentes, telles que la non-détection du transporteur actif de la dopamine Slc6a3 dans les neurones induits, peut-être en raison du manque de facteurs supplémentaires. Une autre étude a déterminé les gènes essentiels pour maintenir ou améliorer la survie des neurones en effectuant un dépistage basé sur l'interférence CRISPR (CRISPRi) (Tian et al., 2019). Et encore une fois, ils se sont limités au criblage de sgRNAs uniques.

D'autres études sont nécessaires pour un dépistage impartial d'autres facteurs génétiques et pour augmenter le nombre de combinaisons de facteurs, car il a été démontré qu'un cocktail de plus de deux facteurs peut être nécessaire dans différents contextes pour conduire efficacement la différenciation et la reprogrammation.

Un bon exemple est la combinaison d'Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc qui est nécessaire pour réguler le réseau de signalisation développemental pour la pluripotence des ESC (Takahashi et Yamanaka, 2006). Dans de tels systèmes complexes, il est nécessaire de caractériser de manière exhaustive les fonctions des combinaisons génétiques d'ordre élevé à haut débit, et la méthode Combinatorial Genetics En Masse (CombiGEM) pourrait bien le faire.

Méthode CombiGEM pour un criblage à haut débit, d'ordre élevé et systématique de combinaisons de facteurs

CombiGEM offre non seulement un moyen systématique de réaliser des criblages groupés à grande échelle, mais a également la capacité d'assemblage évolutif de bibliothèques génétiques combinatoires d'ordre élevé (Wong et al., 2015, 2016 ; Zhou et al., 2020). Le processus en un seul pot permet à l'utilisateur de dépister une multitude de combinaisons génétiques ; Bibliothèques 1-way, 2-way, 3-way et, en théorie, n-way.

Cela fournit une alternative rapide au processus conventionnel de construction et de test de combinaisons de candidats individuels d'intérêt. Alors que plusieurs autres stratégies de dépistage combinatoire CRISPR ont également été développées pour étudier les combinaisons génétiques par paires (Han et al., 2017 ; Shen et al., 2017 ; Najm et al., 2018 ; Truong et al., 2019 ; DeWeirdt et al., 2020 ), CombiGEM offre une opportunité unique d'évaluer les interactions entre trois combinaisons génétiques ou plus.

Par exemple, si l'utilisateur souhaite utiliser CRISPRa ou CRISPRi pour surexprimer ou réprimer, respectivement, une liste de combinaisons TF candidates, on peut cribler une bibliothèque à code-barres de combinaisons sgRNA ciblant TF à l'aide de CombiGEM-CRISPR v2.0 ( Wong et al., 2016 ; Zhou et al., 2020) comme illustré à la figure 1.

En utilisant des étapes de ligature en un seul pot, la bibliothèque de sgARN et leurs codes-barres respectifs sont incorporés dans un vecteur de destination lentiviral qui signale l'expression d'une protéine fluorescente lors de l'activation d'un promoteur spécifique au type de cellule neuronale, tel que la tubuline 1. La bibliothèque d'ARNsg et un vecteur lentiviral séparé hébergeant le Cas9 déficient enzymatiquement, soit fusionné avec un activateur ou un répresseur transcriptionnel, peuvent être délivrés dans les cellules de départ souhaitées.

Au fil du temps, à mesure que les cellules commencent à se différencier, seules les cellules de type neurone induites exprimeront la fluorescence, et ces cellules peuvent être isolées à l'aide d'un tri cellulaire activé par fluorescence pour récupérer leurs combinaisons TF hébergeant via le séquençage de codes à barres.

Pour mieux comprendre les combinaisons qui entraînent des lignées cellulaires spécifiques, ces cellules peuvent également être sondées pour des reporters ou des marqueurs de lignée cellulaire connus en fonction de la préférence des étapes de différenciation que l'utilisateur choisit d'étudier. Le tri cellulaire activé magnétiquement pourrait être utilisé pour séparer les cellules d'intérêt en fonction des expressions des marqueurs de surface cellulaire.

Le séquençage d'ARN unicellulaire pourrait être couplé au dépistage combinatoire CRISPR en tant que lecture pour profiler le type et les niveaux de régulation positive ou négative du gène et la combinaison de TF ciblés peut être déterminée via les lectures de codes à barres (Replogle et al., 2020). L'imagerie à haut contenu pourrait être utilisée pour surveiller les changements de morphologie cellulaire des stades précoces aux stades ultérieurs du développement des neurones.

La pertinence physiologique ou la fonctionnalité des cellules de type neurone induites peut être déterminée par un marquage immunocytochimique spécifique à la maturation des neurones, tels que NeuN, TUJ1 et MAP2, et des mesures électrophysiologiques. Comme mentionné précédemment, des études ont combiné le TF et de petites molécules pour manipuler le destin cellulaire.

CombiGEM peut également être utilisé pour identifier des combinaisons de petites molécules qui peuvent maintenir l'auto-renouvellement des cellules souches, induire une différenciation de la lignée cellulaire ou faciliter la reprogrammation en augmentant l'efficacité et en remplaçant potentiellement les facteurs génétiques. CombiGEM peut également être appliqué en déterminant d'abord les petites molécules cibles des voies de signalisation, des facteurs de processus épigénétiques ou cellulaires.

Ensuite, via la conception d'une bibliothèque d'ARNsg pour activer ou inactiver les cibles médicamenteuses, on peut alors identifier les combinaisons efficaces de petites molécules pour améliorer la différenciation ou la reprogrammation. Ce concept est bien reflété par les études que nous avons menées précédemment pour découvrir des combinaisons de cibles médicamenteuses contre le cancer et la maladie de Parkinson (Zhou et al., 2020).

L'utilisation de CombiGEM n'est pas seulement limitée aux perturbations basées sur CRISPR, mais pourrait également être appliquée à d'autres facteurs de régulation de l'ADN ou de l'ARN pour étudier les écrans de perte de fonction avec interférence ARN, ainsi que ceux de gain de fonction avec l'expression de microARN (Wong et al., 2015) et des cadres de lecture ouverts humains à séquence vérifiée tels que ceux rapportés dans la bibliothèque TFome humaine (Ng et al., 2020).

Méthode CombiSEAL pour l'ingénierie à haut débit des facteurs de transcription

Trouver la combinaison idéale de facteurs génétiques naturels peut encore poser des défis, comme se limiter aux TF caractérisés du génome avec une connaissance préalable de leur expression et de leur rôle dans la différenciation. Des études ont démontré que l'ingénierie des TF ou la génération de facteurs de transcription artificiels ouvrent une nouvelle voie d'options pour accélérer le taux de différenciation par des voies alternatives, dépassant la dépendance de l'expression préalable d'autres cofacteurs endogènes au sein du réseau de régulation des gènes, ou remplaçant complètement TF naturels avec des TF plus efficaces (Jauch, 2018).

Cela permet aux chercheurs d'adapter les facteurs requis en fonction de leurs besoins expérimentaux. Nous proposons que si l'on vise à effectuer une mutagenèse à haut débit sur plusieurs sites sur un TF qui comprend différents domaines, CombiSEAL pourrait s'avérer être une plateforme utile (Choi et al., 2019). La méthode CombiSEAL assemble des fragments d'ADN codant des acides aminés qui sont marqués de manière combinatoire avec des codes-barres (Figure 1).

Figure 1 ｜ Méthodes CombiGEM et CombiSEAL pour dépister les facteurs génétiques efficaces de différenciation. Un exemple de la méthode CombiGEM est l'assemblage de plusieurs ARNsg exprimés à partir de la même construction, et les combinaisons d'ARNsg sont représentées par leurs codes-barres concaténés. La méthode CombiSEAL comprend des mutations introduites dans diverses parties d'une protéine, telles que des facteurs de transcription, indiqués par P1, P2, P(n) et P(n plus 1). Et les combinaisons de mutations sont reflétées par leurs codes-barres concaténés correspondants. L'utilisateur peut appliquer les configurations à d'autres systèmes de livraison d'ADN, et dans cette représentation, des vecteurs lentiviraux sont utilisés. Les stratégies de dépistage peuvent être menées par un format regroupé, et dans cet exemple, l'identification des populations cellulaires qui se différencient en une lignée neuronale spécifique est détectée par l'activation du promoteur pour l'expression de la protéine fluorescente, étiquetée comme fluorescence X dans le diagramme. Le séquençage de nouvelle génération (NGS) des codes-barres du pool cellulaire déchiffrera les cibles ADN ou les variantes transcriptionnelles. Une analyse rigoureuse des facteurs qui déterminent la différenciation des différents types de neurones pourrait utiliser des méthodes basées sur des matrices telles que le sondage des cellules avec des marqueurs de lignée cellulaire suivi d'un tri cellulaire activé magnétiquement (MACS) dans des plaques multipuits, qui peuvent être suivies avec imagerie à haut contenu. Alternativement, le séquençage d'ARN unicellulaire (ARN-Seq) permet à l'utilisateur de profiler les expressions géniques des cellules avec les phénotypes souhaités et serait en mesure de récupérer les codes-barres pour identifier les combinaisons d'ARNsg ou les combinaisons de mutation de la ou des variantes clés. FACS : Tri cellulaire activé par fluorescence.

CombiSEAL commence par les premières parties de sectionnement de la protéine où la mutagenèse est souhaitée. L'utilisateur peut générer n'importe quel nombre de variantes pour chaque section, puis les étiqueter avec des codes-barres pour identifier la position et la combinaison des mutations. Chaque groupe de sections est ensuite assemblé séquentiellement en les insérant dans un vecteur de destination hébergeant la séquence protéique de type sauvage modifiée avec des enzymes IIS de type flanquant au niveau de la région de mutagenèse prévue.

Ce schéma de fusion sans cicatrice consistant à lier plusieurs parties d'une protéine est important pour éviter d'ajouter des acides aminés indésirables à la protéine. La méthode CombiSEAL permet de déterminer les séquences d'acides aminés du pool sélectionné de variants d'intérêt de manière plus efficace et plus rentable, en évitant le besoin d'un séquençage à longue lecture sur l'ensemble de la protéine pour identifier les types de mutations et où elles se situent à travers le protéine.

Cette configuration méthodique permet une analyse plus facile en effectuant un séquençage à haut débit du pool de codes-barres concaténés courts qui déduit la combinaison de types et de positions de mutations d'acides aminés, ou d'autres modifications souhaitées telles que l'échange, l'insertion et la suppression de domaine, qui avaient été initialement conçu et installé sur le TF

Conclusion

Par rapport aux méthodes d'essais et d'erreurs, des progrès ont été réalisés dans l'utilisation d'approches plus systématiques pour déterminer les facteurs essentiels ou les combinaisons nécessaires pour conduire la conversion d'un type de cellule en une lignée neuronale. Cependant, la capacité d'identifier des combinaisons d'ordre supérieur a fait défaut, et nous proposons ici que la méthode CombiGEM peut être en mesure de répondre à ces limitations.

CombiGEM utilise un système de ligature unique à code-barres pour assembler des combinaisons d'ordre supérieur de facteurs de liaison à l'ADN pour cibler l'ADN en une seule fois, contournant le processus de plusieurs cycles de dépistage pour réduire le nombre de résultats à une taille gérable pour les validations en aval . De plus, des TF naturels moins efficaces peuvent être remplacés par des TF artificiels ou modifiés pour mieux réguler l'expression des gènes. Nous décrivons une méthode de mutagenèse protéique, CombiSEAL, qui permettra aux utilisateurs de créer de grands pools de variantes de facteurs de transcription en assemblant simplement plusieurs mutations de sites étiquetées avec des codes à barres dans la protéine et leurs différents domaines.

Cela accélérera et réduira le coût des procédures de dépistage pour récupérer les informations sur les types de mutations des variants d'intérêt. Nous espérons que les méthodes proposées pourront aider à mieux comprendre et élargir les possibilités de promotion de la régénération neuronale et pourront être largement applicables à d'autres domaines de recherche.

Le mécanisme de l'effet neuroprotecteur de Cistanche

Il a été démontré que Cistanche a des effets neuroprotecteurs à travers plusieurs mécanismes :

1. Effets anti-inflammatoires : Cistanche contient des composés qui inhibent l'inflammation dans diverses parties du cerveau, ce qui peut aider à protéger les neurones contre les dommages.

2. Effets antioxydants : Cistanche contient des composés qui ont de fortes propriétés antioxydantes. Les antioxydants aident à protéger les neurones des dommages causés par les radicaux libres et le stress oxydatif.

3. Régulation des neurotransmetteurs : il a été démontré que Cistanche régule certains neurotransmetteurs, tels que la sérotonine et la dopamine, qui peuvent aider à protéger les neurones et à améliorer la fonction cognitive.

4. Stimulation du facteur neurotrophique : Il a été démontré que Cistanche stimule la production de facteurs neurotrophiques, tels que le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF), qui peut favoriser la croissance et la survie des neurones.

Dans l'ensemble, ces mécanismes fonctionnent ensemble pour protéger les neurones des dommages, favoriser leur croissance et leur survie et améliorer la fonction cognitive.

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Dawn GL Thean, Alan SL Wong*