Le conjugué dendrimère-tésaglitazar induit un changement phénotypique des microglies et améliore la phagocytose amyloïde† Partie 1

Faire passer la microglie d'un état « pro-inflammatoire » exacerbant la maladie à un phénotype neuroprotecteur et « anti-inflammatoire » est une stratégie prometteuse pour lutter contre de multiples maladies neurodégénératives.

Les microglies sont un type de cellule du système nerveux central qui est principalement responsable du maintien de la santé et du fonctionnement des neurones. Ils peuvent sécréter une variété de facteurs de croissance et de facteurs neurotrophiques et maintenir l’activité métabolique normale des neurones en éliminant les déchets autour des neurones. Des études menées ces dernières années ont montré que les microglies sont étroitement liées à la mémoire. Jetons-y un coup d'oeil ensemble.

Premièrement, les microglies peuvent stimuler les neurones et favoriser leur activation, améliorant ainsi la mémoire. En libérant une série de neurotransmetteurs, tels que le glutamate et l'alanine, les microglies peuvent favoriser la transmission du signal entre les neurones et améliorer la résonance du signal des neurones gliaux entre les membranes présynaptiques, favorisant ainsi l'excitabilité neuronale et la formation de la mémoire.

Deuxièmement, les microglies peuvent également éliminer les déchets autour des neurones, maintenir une activité métabolique normale des neurones et réduire la mortalité neuronale, favorisant ainsi l’amélioration de la mémoire. Lorsque trop de déchets s’accumulent autour des neurones, cela affectera l’activité métabolique normale des neurones, entraînant la mort neuronale et un affaiblissement de la fonction, réduisant ainsi les performances de la mémoire. Les microglies peuvent maintenir l'environnement métabolique normal des neurones et réduire la mortalité neuronale en engloutissant et en décomposant les déchets environnants, améliorant ainsi la mémoire.

En résumé, les microglies sont étroitement liées à la mémoire. En favorisant l’excitation des neurones et en éliminant les déchets environnants, les microglies peuvent améliorer encore davantage la mémoire et maintenir notre cerveau sain et actif. Nous devons veiller à protéger la santé des microglies pour obtenir une meilleure mémoire. On peut voir que nous devons améliorer la mémoire, et le Cistanche peut améliorer considérablement la mémoire car le Cistanche est une matière médicinale traditionnelle chinoise avec de nombreux effets uniques, dont l'un est d'améliorer la mémoire. L'efficacité du Cistanche provient des différents ingrédients actifs qu'il contient, notamment l'acide tannique, les polysaccharides, les glycosides flavonoïdes, etc. Ces ingrédients peuvent favoriser la santé cérébrale de diverses manières.

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Les microglies proinflammatoires contribuent à la progression de la maladie en libérant des substances neurotoxiques et en accélérant l’accumulation de protéines pathogènes. Il a été démontré que le PPAR et les agonistes du PPAR font passer les microglies d'un phénotype pro-inflammatoire (« M1-like ») à un phénotype alternativement activé (« M2-like »). De telles stratégies ont été explorées dans des essais cliniques sur des maladies neurologiques, telles que les maladies d'Alzheimer et de Parkinson, mais ont probablement échoué en raison de leur faible pénétration de la barrière hémato-encéphalique (BBB).

Il a été démontré que les dendrimères polyamidoamines à terminaison hydroxyle (sans fixation de ligands de ciblage) traversent la BHE altérée au site de la neuroinflammation et s'accumulent dans la microglie activée.

Par conséquent, la conjugaison de dendrimères d’un PPAR/agoniste double peut permettre une commutation phénotypique ciblée des microglies activées. Nous présentons ici la synthèse et la caractérisation d'un nouveau conjugué dendrimère-PPAR / double agoniste (D-tesaglitazar).

In vitro, le D-tesaglitazar induit un changement de phénotype « M1 vers M2 », diminue la sécrétion d'espèces réactives de l'oxygène, augmente l'expression des gènes de phagocytose et de dégradation enzymatique des protéines pathogènes (par exemple -amyloïde, -synucléine) et augmente la phagocytose -amyloïde.

Ces résultats soutiennent le développement ultérieur du D-tésaglitazar en vue d'une application pour plusieurs maladies neurodégénératives, en particulier la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson.

Introduction

Aux États-Unis seulement, on compte actuellement plus de 5,3 millions de personnes atteintes de la maladie d'Alzheimer (MA) et 1 million de personnes atteintes de la maladie de Parkinson (MP).1 L'âge étant le facteur de risque le plus important pour de nombreuses maladies neurodégénératives, la prévalence et le coût du traitement de ces maladies continuera à augmenter à mesure que la population vieillira.

De plus, l’absence de succès récent dans le développement de nouveaux médicaments pour traiter ces maladies a mis en évidence la nécessité de développer des thérapies innovantes.2,3 Ces échecs cliniques mettent en évidence les difficultés rencontrées dans le développement d’un médicament, notamment l’administration d’une concentration suffisamment élevée du médicament au cerveau pour qu’il soit efficace sans provoquant des effets secondaires indésirables.

Les maladies neurodégénératives telles que la MA et la MP partagent trois composantes neuropathologiques majeures : la neuroinflammation, l'accumulation de protéines pathogènes et la mort neuronale.4–7 Chez les personnes en mauvaise santé, la cellule immunitaire innée du cerveau (la microglie) phagocyte constamment les protéines mal repliées (par exemple -amyloïde, -synucléine). ) qui provoquent la mort neuronale au fur et à mesure de leur production, ce qui empêche la formation des agrégats caractéristiques.

Cependant, chez les personnes qui finissent par développer des maladies neurodégénératives, les microglies n’éliminent plus ces protéines efficacement et se transforment en un phénotype proinflammatoire exacerbant la maladie (généralement désigné par M1).

Bien que la classification de l'activation microgliale à prédominance pro-inflammatoire/anti-inflammatoire (M1/M2) soit une simplification excessive du spectre de polarisation des macrophages, elle est toujours utilisée comme une nomenclature large pour décrire le phénotype dominant des microglies dans la neuroinflammation et la réponse au traitement.

Les microglies de type M1- libèrent des espèces réactives de l'oxygène et d'autres médiateurs inflammatoires qui induisent à la fois la mort neuronale et exacerbent la pathologie de la maladie en augmentant la production de protéines pathogènes (par exemple -amyloïde, -synucléine).

De plus, les principaux facteurs de risque génétiques de développement de la MA (TREM2 et APOE) sont exprimés à des niveaux élevés dans les microglies, et il a été démontré que la voie TREM2/APOE provoque un changement de phénotype amicroglial dans la MA, la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la sclérose en plaques. modèles animaux.8

Ces résultats démontrent en outre le rôle des microglies dans la pathologie de plusieurs maladies neurodégénératives humaines. Une approche visant à manipuler le phénotype des microglies permettrait aux chercheurs de comprendre leur rôle dans les maladies neurodégénératives, en plus d'être potentiellement une thérapeutique efficace.

Le passage des microglies d'un phénotype M1 à un phénotype anti-inflammatoire et neuroprotecteur (M2) a été proposé comme stratégie thérapeutique pour traiter plusieurs maladies neurodégénératives.5,6Il a été démontré que deux agonistes du PPAR actuellement approuvés par la FDA, les médicaments contre le diabète de type II, la rosiglitazone et la pioglitazone, induisent un Changement de phénotype M1 vers M2 dans les macrophages et les microglies in vitro et in vivo.

Il a été démontré que les agonistes du PPAR réduisent la sécrétion d'espèces réactives de l'oxygène induite par le LPS en réduisant l'activité du NF-κB en induisant la dégradation et l'exportation du NF-κB à partir du noyau, ainsi qu'une transrépression dépendante du ligand.11

De plus, des études épidémiologiques ont montré que les patients diabétiques qui prennent de la rosiglitazone ou de la pioglitazone présentent un risque réduit de développer une MA et une MP.12 Par la suite, la rosiglitazone et la pioglitazone ont été étudiées dans le cadre d'essais cliniques de phase III sur la MA, mais ont échoué.13

Une explication probable de l’échec des essais cliniques mentionnés ci-dessus est le mauvais transport de ces médicaments à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE), limitant ainsi le nombre de médicaments atteignant le cerveau des patients inclus dans ces essais cliniques.14

En effet, on estime que la BHE empêche environ 98 % de tous les médicaments à petites molécules d’atteindre le cerveau, et que seule une fraction du médicament qui pénètre dans le cerveau atteint la microglie.15

De plus, le PPAR est un autre récepteur nucléaire de la famille des PPAR.16 Il joue un rôle dans l'homéostasie lipidique et la régulation de l'inflammation, et il a également été démontré que les agonistes du PPAR présentent des effets anti-inflammatoires dans la microglie.

Des études cliniques utilisant la neuroimagerie, l'analyse tissulaire post-mortem et les biomarqueurs du LCR ont fourni la preuve que le BBB est altéré dans la MA et la MP, ainsi que dans d'autres maladies neurodégénératives.

Il a été démontré que les dendrimères de polyamidoamine à terminaison hydroxyle (G4-PAMAM-OH) de 17 générations -4 contournent intrinsèquement la BHE altérée et s'accumulent dans la microglie activée sans avoir besoin de cibler des ligands, après une administration systémique dans plusieurs modèles de maladies neuroinflammatoires différents. , y compris chez les rongeurs, les lapins, les chiens et les primates non humains.18–28 De manière significative, G4-PAMAM-OH peut être administré par voie systémique et traverser la BHE dans des modèles de maladie présentant une légère perturbation de la BBB, comme le syndrome de Rett.29

De plus, l'étendue de l'absorption de G4-PAMAM-OH dans le cerveau est directement proportionnelle à la gravité de la maladie dans un modèle de paralysie cérébrale chez le lapin.30 Les dendrimères à terminaison hydroxyle ont l'avantage d'être administrés de manière non invasive par rapport à l'administration locale hautement invasive par voie cérébrale. le crâne requis dans des études antérieures avec d'autres nanoparticules telles que la poly-εcaprolactone et le PEG, des dendrimères PAMAM chargés négativement, des points quantiques et des nanoformulations composées de polyéthylèneimine (PEI) et de sulfate de dextrane.31–35

De plus, ces dendrimères hydroxyles PAMAM sont idéalement positionnés pour la traduction en raison de leur évolutivité et de leur profil de sécurité in vivo bien toléré.36–38 En raison de données d'efficacité précliniques positives, un (G4-PAMAM-OH) -N- Le conjugué acétyl-cystéine est actuellement évalué dans les premiers essais cliniques sur l'adrénoleucodystrophie cérébrale chez l'enfant (NCT03500627) et l'inflammation associée à la maladie grave à coronavirus 2019 (COVID-19) (NCT04458298).

Nous avons étudié un conjugué dendrimère-médicament de tesaglitazar (Tesa) attaché au PAMAMdendrimère de génération -4 à terminaison hydroxyle. Tesaglitazar est un puissant agoniste double du PPAR qui combine les effets bénéfiques du PPAR et des agonistes du PPAR. Il contient un groupe fonctionnel acide carboxylique pour la conjugaison covalente au dendrimère et pour sa libération ultérieure.

D'autres guitares ont été développées et testées cliniquement, mais Tesa a été choisie en raison de son rapport d'activité PPAR/PPAR plus élevé, de sa structure chimique relativement simple et de son profil de sécurité.39–43

Tesa a déjà atteint des essais cliniques de phase III pour le diabète de type 2 aux États-Unis d'Amérique, mais a échoué en raison d'une toxicité dose-dépendante, qui peut être évitée en diminuant la dose d'administration nécessaire par l'administration contrôlée de dendrimères.39,40,44 Puisque Tesa est un PPAR/double agoniste, son administration ciblée aux microglies activées au niveau du site de la neuroinflammation pourrait être très bénéfique.

Ici, nous démontrons la synthèse et la caractérisation d'un conjugué dendrimère-tésaglitazar (D-Tesa) et démontrons la capacité de ce composé à induire un changement de phénotype « M1 vers M2 » dans la microglie et à améliorer la phagocytose de l'amyloïde marqué par fluorescence.

Matériels et méthodes

Matériels

1-[3-(Diméthylamino)propyl]-3-méthiodure de carbodiimide d'éthyle (EDC), 4(diméthylamino)pyridine (DMAP), CuSO4·5H2O, ascorbate de sodium, acide hexynoïque et albumine sérique bovine (BSA) ont été achetés auprès de Sigma Aldrich US et utilisés tels que reçus (St Louis, MO).

Le tesaglitazar a été obtenu auprès d'AstaTech Inc. (Bristol, PA). Le dendrimère PAMAM à noyau d'éthylènediamine (génération 4 avec 64 groupes terminaux hydroxyle) a été reçu de Dendritech Inc. (Midland, MI) sous forme d'une solution dans du méthanol.

Le dendrimère a été stocké dans du méthanol à 4 degrés et le méthanol a été évaporé avant utilisation. Une membrane de dialyse avec un seuil de poids moléculaire (MWCO) de 1 kDa a été achetée auprès de Spectrum Laboratories Inc. (Nouveau-Brunswick, NJ).

Tous les autres solvants ont été utilisés tels quels sous leurs formes anhydres. Toutes les réactions, à l'exception des réactions click de cuivre (I), de cycloaddition alcyne-azide catalysée (CuAAC), ont été réalisées dans des conditions anhydres dans un milieu organique avec de la verrerie séchée au four sous un azote inerte. atmosphère.

Pour la culture cellulaire : le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), le sérum bovin fœtal (FBS), la pénicilline-streptomycine (P/S), la trypsine-EDTA à 0,05 % et le réactif MTT ont été obtenus auprès d'Invitrogen (Carlsbad, CA , États-Unis).

Le réactif de Griess a été obtenu auprès de Promega (Madison, WI) et le TNF-ELISA a été obtenu auprès de R&D Systems (Minneapolis, MN). Du méthanol de qualité analytique a été acheté auprès de Sigma-Aldrich. Le bleu trypan a été obtenu auprès de Corning (Manassas, VA, USA).

Procédures de synthèse des conjugués D-Tesa
Le monoazide de tétraéthylèneglycol (2) a été synthétisé en utilisant un protocole publié précédemment.45

Synthèse et purification du Tesa-TEG-azide (3).
Du Tesa (950 mg, 2,32 mmol) a été dissous dans 10 ml de diméthylformamide (DMF). A cette solution agitée, du mono-azide de tétraméthylèneglycol (2 662,1 mg, 3,02 mmol) dans du DMF (1 ml) a été ajouté goutte à goutte. Du DMAP (255,4 mg, 2,09 mmol) et de l'EDC (577,5 mg, 3,02 mmol) ont ensuite été ajoutés au mélange réactionnel, et la réaction a été agitée sous purge d'azote à température ambiante pendant 24 heures.

La réaction a été surveillée par chromatographie sur couche mince et chromatographie liquide haute performance (HPLC). Le mélange réactionnel a été dilué avec 100 ml de dichlorométhane (DCM) et le mélange réactionnel brut a été transféré dans une ampoule à décanter, et la couche organique a ensuite été lavée trois fois avec une solution saturée de bicarbonate de sodium, puis avec une solution saturée de chlorure d'ammonium et enfin avec de la saumure.

La couche organique a ensuite été séchée avec du sulfate de sodium anhydre. Le solvant dans la couche organique a ensuite été éliminé à l'aide d'un évaporateur rotatif, et la solution a été redissoute dans 3 ml de DCM et absorbée sur du gel de silice pour être purifiée avec un système de chromatographie CombiFlash® en utilisant une méthode de gradient avec de l'acétate d'éthyle/hexane comme solvants pour produire 3 aussi clair. -huile jaune.

Le produit pur souhaité est élué à environ 30–40 % d'acétate d'éthyle. (Rendement : 70 %). 7,08 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,73 (d, J=8,6 Hz,2H), 4,25–4,14 (m, 2H), 4,07 (t, J {{ 33}},8 Hz, 2H), 3,94 (dd, J =7,8, 5,2 Hz, 1H), 3,67–3,47 (m, 14H), 3,30 (dd, J=8,7 , 3,8 Hz, 2H), 3,06 (s, 3H), 3,02 (t, J=6,7 Hz, 2H), 2,91–2,84 (m, 2H), 1,08 (t, J=7 .0 Hz, 3H).ESI-MS : théorique C28H39N3O10S : 609,24, obtenu (M + 1) : 610,13.

Synthèse et purification du D-YNE (5).

(480 mg, 4,22 mmol) ont été ajoutés à une solution agitée de G4-PAMAM-OH (2,5 g, 0,176 mmol) dans 20 ml de DMF anhydre. A ce mélange, du DMAP (430 mg, 3,52 mmol) et de l'EDC (1 g, 5,28 mmol) ont été ajoutés.

Le mélange réactionnel a été agité sous purge d'azote pendant 24 heures à température ambiante. Une fois la réaction terminée, le mélange réactionnel a été transféré dans un tube de dialyse de 1 000 MWCO. Une dialyse au DMF a été effectuée pendant 24 heures et le DMF a été changé environ toutes les six heures.

Ensuite, une dialyse avec de l'eau déminéralisée (DI) a été réalisée pendant 24 heures, l'eau étant changée environ toutes les six heures. Enfin, le contenu du tube de dialyse résultant a été lyophilisé pendant 48 heures, donnant une poudre blanche et pelucheuse. (Rendement : 61 %). surface du dendrimère OH), 4,01 (t,ester –CH2), 3,32 (m, dendrimère –CH2), 3,06 (m, dendrimère et lieur –CH2), 2,85–2,58 (m, dendrimère –CH2), 2,56–1,89 (m, dendrimère et lieur –CH2), 1,78–1,61 (m, lieur –CH2).Synthèse et purification de D-Tesa (6).

Du tesa-TEG-azide (3 177,8 mg, 0,3{{10}}3 mmol) a été ajouté à un mélange agité de D-YNE (5, 35{{2{{27} }}} mg, 0,023 mmol) dans 5 ml d'un mélange 1: 1 de tétrahydrofurane (THF) et d'eau avec 0,5 ml de DMF dans un flacon de 20 ml allant au micro-ondes. Pour la réaction click CuAAC, du sulfate de cuivre pentahydraté (11,6 mg, 0,0467 mmol) et du (+)-lascorbate de sodium (9,3 mg, 0,0467 mmol) ont été ajoutés au mélange réactionnel.

Le flacon a été scellé et le récipient de réaction a ensuite été placé dans un réacteur micro-ondes Biotage® Initiator et mis à réagir sous un rayonnement micro-ondes de 20 W sous agitation pendant 8 heures à 50 degrés. Le mélange réactionnel a été transféré dans un tube de dialyse de 1 000 MWCO et une dialyse au DMF a été réalisée pendant 24 heures, le DMF étant remplacé par un solvant frais environ toutes les 4 heures.

Ensuite, le contenu du tube de dialyse a été transféré dans un tube Afalcon et une quantité équivalente d'eau DI a été ajoutée. De plus, 200 µl de solution de sel disodique d'acide éthylènediaminetétraacétique ont été ajoutés au contenu du tube Falcon.

Ce mélange a ensuite été placé dans un nouveau tube de dialyse de 1 000 MWCO et la dialyse a été effectuée pendant 12 heures dans 1 000 ml d'eau DI avec une solution d'EDTA ajoutée, suivie d'une dialyse à l'eau pendant 12 heures.

Le mélange a ensuite été lyophilisé pendant 48 heures et a donné lieu à une poudre blanche et pelucheuse. (Rendement : 64 %). (d, TesaArH), 6,76 (d, Tesa ArH), 4,37 (s, Tesa H), 4,18–4,04 (m, linkerH), 3,96 (dd, Tesa et linker H), 3,70 (m, Tesa et linker H) ,3,58–3,14 (m, dendrimère –CH2), 3,14–2.86 (m, dendrimère –CH2), 2,87–2,49 (m, dendrimère et lieur –CH2), 2,25 (m, dendrimère –CH2) , 1,82-1,67 (m, lieur –CH2), 0,97 (t, Tesa –CH3).

Techniques de caractérisation

Résonance magnétique nucléaire (RMN). Les spectres RMN ont été enregistrés sur un spectromètre Bruker 500 MHz à température ambiante. Les déplacements chimiques des protons (δ) sont indiqués en ppm.

La RMN 1H a été utilisée pour déterminer le nombre de molécules Tesa attachées à chaque molécule de D-Tesa par la méthode d'intégration de protons, en comparant les pics des protons d'amide interne du dendrimère à δ 7,6–8,2 ppm avec les protons aromatiques de Tesa à δ 7,36–6,76 ppm et les protons méthyle de Tesa dans la région aliphatique. Chromatographie liquide haute performance (HPLC).

Une HPLC (Waters Corporation, Milford, Massachusetts) équipée d'une pompe binaire 1525, d'un dégazeur AF en ligne, d'un échantillonneur automatique 717 plus, d'un détecteur à réseau de photodiodes 2998 et d'un détecteur multi-fluorescence λ 2475 interfacé avec le logiciel Waters Empower a été utilisée.

Une colonne à phase inverse Symmetry C18 (Tosoh, Japon) ayant une taille de particules de 5 µm, une longueur de 25 cm et un diamètre interne de 4,6 mm a été utilisée. Les composés ont été surveillés à 210 nm et 254 nm à l'aide des détecteurs PDA.

Le solvant A était de l'eau de qualité HPLC avec 0,1 % d'acide trifluoroacétique (TFA) et le solvant B était de l'acétonitrile (ACN) avec 5 % d'eau et 0,1 % de TFA. La méthode utilisée a commencé à 1 { {7}}0 : 0 (ACN : eau), a diminué à 10 : 90 (eau : ACN) en 5 minutes, est resté à cette polarité pendant 15 minutes et est revenu à 100 : 0 (ACN : eau) en 5 minutes. minutes. Le débit a été maintenu à 1 ml min−1. Spectroscopie de masse.

L'ESI-MS a été réalisée sur un spectromètre de masse BrukermicroTOF-II en utilisant de l'acétonitrile/eau (9 : 1) comme système solvant. Les ions moléculaires sous forme de pics protonés [M + nH]n+ ou d'adduits [M + nX]n+ (X=Na, K ou NH4) ont été utilisés pour confirmer la formule empirique.

Diffusion dynamique de la lumière et potentiel ζ. Un Zetasizer NanoZS (Malvern Instrument Ltd, Worchester, Royaume-Uni) équipé d'un laser He – Ne de 5 0 mW (633 nm) a été utilisé pour déterminer la taille des particules et la distribution du potentiel ζ. Le D-Tesa a été dissous dans de l'eau DI à une concentration de 0,2 mg ml-1 pour le DLS et dans du chlorure de sodium 10 mM à une concentration de 0,1 mg ml-1 pour le potentiel ζ.

Les mesures ont été effectuées à 25 degrés, en utilisant un angle de diffusion de 173 degrés, comme décrit précédemment.27,46Étude sur la libération du médicament. Le D-Tesa a été dissous à une concentration de 1 mg ml-1 dans une solution tampon phosphate (pH 7,4) pour imiter des conditions plasmatiques ou dans une solution de citrate de sodium (pH 5,5) pour imiter des conditions lysosomales.

Des estérases de foie de porc (de Sigma Aldrich) ont été ajoutées à la solution de citrate de sodium au début de l'étude de libération et ont été reconstituées environ tous les 3 jours pendant l'étude.

Chaque flacon contenait 15 ml d'échantillon et était continuellement secoué à 37 degrés pendant toute la durée de l'expérience. À différents moments, des échantillons en double de 200 µl de chaque pH ont été collectés et l'activité estérase a ensuite été désactivée en ajoutant 200 µl de méthanol. Des échantillons à un moment zéro heure ont servi de contrôle.

Les échantillons ont été stockés à -80 degrés pour éviter davantage toute hydrolyse. Les échantillons ont ensuite été analysés par HPLC et l'aire sous la courbe (à 210 nm) du pic de médicament libre a été calculée. L'aire sous la courbe a été corrélée à la quantité de médicament libérée en utilisant une courbe d'étalonnage dans laquelle les concentrations connues de Tesa libre ont été analysées sur HPLC à 210 nm.

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