Le conjugué dendrimère-tésaglitazar induit un changement phénotypique des microglies et améliore la phagocytose amyloïde† Partie 3

D-Tesa a augmenté l'expression d'enzymes responsables de l'élimination des protéines pathogènes

L'enzyme de dégradation de l'insuline (Ide) et la métalloprotéase matricielle 9 (MMP9) sont des enzymes sécrétées par les microglies qui dégradent l'amyloïde et la synucléine extracellulaires.71,72 Le traitement par D-Tesa a significativement augmenté l'expression de l'Ide 3.1- fois (p < 0.001) avec une tendance à l'augmentation de l'expression de MMP9 (augmentation de 1,8- fois, p=0.057) par rapport aux contrôles traités uniquement au LPS (Fig. 6A et B).

Ces dernières années, de plus en plus d’études ont montré qu’il existe un lien étroit entre les enzymes dégradant l’insuline et la mémoire. Cette découverte nous fournit des indices précieux pour explorer davantage le mécanisme de formation et de maintien de la mémoire.

L’enzyme de dégradation de l’insuline est une enzyme importante dont la fonction principale est de décomposer l’insuline afin de maintenir l’équilibre glycémique. Cependant, des études récentes ont montré que l'enzyme dégradant l'insuline joue non seulement un rôle métabolique, mais affecte également directement la croissance et la réparation des neurones du cerveau et joue un rôle important dans le maintien de la mémoire.

De nombreuses études ont montré que plus le niveau d’enzyme dégradant l’insuline est élevé, meilleure est la mémoire. En effet, les enzymes dégradant l’insuline peuvent favoriser la croissance et la réparation des neurones, améliorant ainsi la capacité d’apprentissage et de mémoire du cerveau. De plus, les enzymes dégradant l’insuline peuvent également favoriser la connexion entre les neurones, améliorant ainsi l’association et la rétention de la mémoire.

Le rôle important des enzymes dégradant l’insuline dans la mémoire a été largement utilisé dans le domaine de la médecine clinique. Les chercheurs ont découvert qu’en inhalant des enzymes dégradant l’insuline, non seulement la mémoire peut être améliorée, mais également les capacités cognitives et les symptômes dépressifs.

En bref, le lien entre les enzymes dégradant l’insuline et la mémoire est un domaine très important, qui nous fournit des indices précieux pour étudier le mécanisme biologique de la mémoire. Les recherches futures exploreront davantage la fonction et le rôle des enzymes dégradant l’insuline, nous aideront à mieux comprendre le mécanisme de formation et de stockage de la mémoire et fourniront une meilleure base pour améliorer la capacité d’apprentissage et de mémoire du cerveau humain. On voit que nous devons améliorer la mémoire, et Cistanche peut améliorer considérablement la mémoire car Cistanche peut également réguler l'équilibre des neurotransmetteurs, comme en augmentant les niveaux d'acétylcholine et de facteurs de croissance, qui sont très importants pour la mémoire et l'apprentissage. En outre, Cistanche peut également améliorer la circulation sanguine et favoriser l'apport d'oxygène, ce qui peut garantir que le cerveau reçoive suffisamment de nutrition et d'énergie, améliorant ainsi sa vitalité et son endurance.

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Free Tesa a augmenté de manière significative l'expression de Ide 2- fois (p=0 0,011) et a augmenté de manière non significative MMP 92- fois (p=0 0,35) (Fig. 6A et B). Les microglies M2 dans les maladies neurodégénératives peuvent éliminer l'amyloïde, la synucléine et d'autres protéines pathogènes via une dégradation enzymatique ou une phagocytose, et D-Tesa régule positivement les protéines impliquées dans ces processus (c'est-à-dire Ide et MMP9).71–73.

L'idéexpression est régulée négativement dans les pathologies de la MA et de la MP et est connue pour être régulée positivement par les agonistes du PPAR, ce qui concorde avec nos résultats.

71,72 Sur le plan fonctionnel, il a été démontré que seule une augmentation de 2- fois des niveaux d'Ide diminue l'accumulation d'amyloïde et la mort neuronale in vivo.74,75 Par conséquent, l'augmentation de 3- fois des niveaux d'Ide observée par D-Tesa, et Une augmentation 2- fois de l'Ide par freeTesa pourrait être thérapeutiquement efficace in vivo.

D-Tesa augmente la phagocytose de l'amyloïde

Le CD36 est un récepteur microglial piégeur qui facilite la phagocytose et la dégradation de la -amyloïde.73 Sa régulation négative dans la MA entraîne une diminution de l'élimination de la -amyloïde, mais elle est régulée positivement par l'activation du PPAR.

Le D-Tesa et le Tesa libre ont tous deux augmenté de manière significative les niveaux d'expression de CD36 par rapport aux cellules exposées au LPS uniquement (p < 0.0001 contre p < 0,005 pour le D-Tesa et le Tesa libre. , respectivement), mais le D-Tesa était beaucoup plus efficace que le Tesa libre (6- fois plus contre 2, 8- fois plus pour le D-Tesa et le Tesa libre, respectivement, p < 0,0005) (Fig. 6C ).

Nos résultats sont cohérents avec des études antérieures sur la pioglitazone (un autre agoniste du PPAR) qui ont montré qu'une phagocytose microgliale accrue de l'amyloïde se produit par le biais d'un mécanisme dépendant du PPAR et du CD36-.73

Pour déterminer si la régulation positive de CD36 provenant du traitement par D-Tesa était corrélée à la capacité phagocytaire accrue de ces cellules, nous avons effectué un test de phagocytose fonctionnelle de -amyloïde. 73

En bref, après avoir traité les cellules comme nous l'avons fait lors des tests in vitro précédents, nous avons appliqué du -amyloïde 1 à 42 marqué par fluorescence sur les cellules pendant deux heures, lavé les cellules, puis effectué une cytométrie en flux pour étudier l'étendue de l'absorption cellulaire du -amyloïde. D-Tesa a augmenté à la fois le pourcentage de cellules phagocytant l'amyloïde et la quantité moyenne d'amyloïde internalisée par cellule (Fig. 7A et B).

En revanche, le Tesa libre n'a apporté aucune amélioration dans la phagocytose de l'amyloïde. Les effets supérieurs du D-Tesa par rapport à ceux du Tesa sont probablement attribuables à une internalisation cellulaire améliorée rendue possible par la conjugaison des dendrimères.

Ceci est cohérent avec des travaux antérieurs qui ont démontré que plus de 95 % des cellules BV2 traitées avec du G4-PAMAM-OH marqué par fluorescence avaient internalisé le dendrimère en trente minutes et avaient continué à internaliser le dendrimère pendant au moins 24 heures.76

De même, la conjugaison de la minocycline à petite molécule avec du G4-PAMAM-OH marqué par fluorescence a démontré que 99 % des cellules BV2 avaient internalisé le conjugué dendrimère-médicament marqué par fluorescence en 3 heures.26 Ils ont également montré que le conjugué réduisait les niveaux de monoxyde d'azote de manière supérieure. au médicament libre après avoir traité les cellules BV2 avec du LPS, ce qui concorde avec nos résultats.

Les cellules traitées avec le D-Tésaphagocytaient 1,9-fois plus d'amyloïde que les cellules témoins traitées au LPS (p < 0,001), ce qui est comparable à l'augmentation de 2,5-fois de -phagocytose amyloïde par les cellules microgliales primaires de rat traitées avec la pioglitazone rapportée par Yamanaka et al.73. L'étendue légèrement plus élevée de la phagocytose -amyloïde par l'étude précédente pourrait être due soit au fait qu'ils n'ont pas co-traité leurs cellules avec du LPS comme nous l'avons fait, soit au fait que les microglies primaires expriment le PPAR à un niveau plus élevé que les cellules BV2 utilisées dans cette étude.77

En tant que telle, une dose de D-Tesa inférieure à celle estimée à partir des expériences in vitro de notre étude peut probablement être efficace dans les études in vivo et chez les humains, car on sait que les cellules BV2 expriment le PPAR à des niveaux inférieurs à ceux des microglies primaires.77

Les microglies ont été impliquées dans de nombreuses maladies neurodégénératives, et la BBB a empêché de nombreux médicaments susceptibles de modifier le phénotype des microglies d'un phénotype M1 pro-inflammatoire et neurotoxique à un phénotype M2 anti-inflammatoire et neuroprotecteur d'atteindre des niveaux thérapeutiques dans le cerveau.5,6, 14,15

Par exemple, deux agonistes du PPAR, la pioglitazone et la rosiglitazone, ont chacun été étudiés dans le cadre d'essais cliniques de phase III sur la maladie d'Alzheimer en raison de leur capacité à modifier le phénotype des microglies, mais ont probablement échoué en raison d'un mauvais transport à travers la BHE.13,14 Il existe donc un intérêt clinique à modifier le phénotype des microglies dans les maladies neurodégénératives.

Une telle approche nécessite l’administration du médicament aux microglies à des niveaux suffisants pour déclencher une réponse. À cette fin, il a été démontré que les dendrimères G4-OH-PAMAM délivrent des médicaments aux microglies dans de nombreux modèles animaux après injection systémique et, par conséquent, sont actuellement évalués dans des essais cliniques pour le traitement du ccTLD (NCT03500627) et du COVID grave. -19 inflammation associée (NCT04458298).18–28

Pour combiner les effets bénéfiques de la modification du phénotype microglial avec la capacité d'administrer des médicaments aux microglies, nous avons conjugué le tesaglitazar (un PPAR / agoniste double) à un dendrimère G4-OH-PAMAM (Fig. 1–3). Nous avons démontré que D-Tesa est capable de modifier le phénotype des microglies M1 vers un phénotype M2 (Fig. 4 et 5), entraînant une diminution de la sécrétion d'espèces réactives nocives de l'oxygène.

De plus, nous avons démontré que les microglies traitées avec D-Tesa augmentent leur expression d'enzymes qui dégradent les protéines pathologiques telles que la -synucléine et la -amyloïde, ainsi qu'une régulation positive de la phagocytose de la -amyloïde dans un test fonctionnel (Fig. 6 et 7).

Bien que nous ne présentions pas de données démontrant la capacité du D-Tesa à contourner la BHE et à s'accumuler dans la microglie, nous avons déjà montré que les conjugués de médicaments G4-OH-PAMAM avec une charge de médicament, une taille et un potentiel zêta similaires sont capables de passer par le altération de la BBB et accumulation de microglies après administration intraveineuse.26,36,52

Ces résultats soutiennent le développement ultérieur du D-Tesa pour le traitement de plusieurs maladies neurologiques. Bien que nous nous concentrions sur les maladies d'Alzheimer et de Parkinson dans cet article, le D-Tesa a le potentiel d'une application clinique dans plusieurs troubles neurologiques. En raison du rôle similaire des microglies dans la pathologie de plusieurs maladies neurodégénératives, la pioglitazone, agoniste du PPAR, a également été étudiée ou est actuellement étudiée dans des essais cliniques de phase II pour la maladie de Parkinson78, la SLA79, l'adrénomyéloneuropathie (NCT03864523), la sclérose en plaques (NCT03109288) et l'hématome. résolution de l'hémorragie intracérébrale (NCT00827892).

Si ces essais cliniques échouent également en raison d'une mauvaise administration de pioglitazone à travers la BBB, D-Tesa pourrait surmonter cet obstacle à l'administration et traiter les patients atteints de ces maladies.

D'autres groupes ont utilisé des nanoparticules pour améliorer la délivrance d'agonistes du PPAR aux macrophages, mais ils n'ont pas tenté de délivrer ces agonistes aux microglies. Osinski et al. ont démontré que les liposomes chargés en Tesa étaient principalement absorbés par les macrophages de la graisse blanche viscérale dans un modèle d'obésité masculine déficiente en leptine.80

Ils ont également démontré que les liposomes chargés par Tesa ne modifiaient pas l'expression du marqueur M1 Mcp-1, mais augmentaient l'expression du marqueur M2 Arg1, tandis que le traitement avec Tesa libre diminuait le nombre total de macrophages M1 et l'expression de Mcp{{6. }}, et n'a pas augmenté l'expression de Arg1.

Nakashiro et coll. utilisé des nanoparticules de poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA) pour délivrer de la pioglitazone (un agoniste du PPAR) aux macrophages dans le contexte de l'athérosclérose.81

In vivo, ils ont démontré que le PLGA-pioglitazone réduisait les niveaux de cellules immunitaires dans le sang. Dans les macrophages primaires dérivés de la moelle osseuse traités avec du LPS et de l'interféron, ils ont constaté que la PLGA-pioglitazone augmentait l'IL-4 et l'IL-10 (marqueurs M2) et ne diminuait pas les niveaux d'IL-6 ou de TNF.

Leurs conclusions sont similaires aux nôtres ; Les marqueurs M2 ont été augmentés par le traitement agoniste des nanoparticules-PPAR, tandis que les niveaux d'IL-6 et de TNF- n'ont pas diminué. Di Mascolo et coll. utilisé des nanoparticules d'alcool polyvinylique PLGA pour délivrer de la rosiglitazone (un autre agoniste du PPAR).82

In vitro, ils ont démontré que leurs complexes nanoparticules-médicament diminuaient l'expression d'iNOS, de TNF- et d'IL-1 dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse. Ils ont prétraité leurs cellules avec le médicament nanoparticulaire avant de les stimuler avec du LPS, tandis que nous avons prétraité les cellules avec du LPS avant de traiter avec D-Tesa, ce qui pourrait être une raison pour laquelle nous n'avons pas observé de diminution du TNF et de l'IL-1, bien que nous ayons également observé une diminution de l'expression d'iNOS.

Conclusion

Il n’existe actuellement aucun traitement modifiant la pathologie pour de nombreuses maladies neurodégénératives et, à mesure que la population continue de vieillir, la prévalence et le coût du traitement de ces maladies continueront d’augmenter, soulignant le besoin urgent de trouver une solution. Récemment, les microglies pro-inflammatoires M1 jouent un rôle essentiel dans la pathologie de plusieurs maladies neurodégénératives.

Par la suite, être capable d'administrer un médicament à travers la barrière hémato-encéphalique qui peut induire un changement de phénotype « M1 vers M2 » dans la microglie présente un potentiel thérapeutique pour plusieurs maladies, en particulier les maladies d'Alzheimer et de Parkinson.

D-Tesa a été conçu pour délivrer un médicament induisant « M1 à M2 » à la microglie après administration systémique afin de réduire la sécrétion microgliale de substances neurotoxiques, tout en induisant également un état anti-inflammatoire qui augmente la dégradation et la phagocytose des protéines pathogènes dans le cerveau. Nous avons synthétisé avec succès le D-Tesa en utilisant une approche de chimie clic très efficace.

Le médicament est attaché au dendrimère via une liaison ester qui est clivable de manière intracellulaire dans des conditions lysosomales, environ 60 % de Tesa étant libéré au cours des 48 premières heures dans des conditions lysosomales.

Il a été démontré que D-Tesa est supérieur à Tesa in vitro pour induire un changement de phénotype M1 vers M2a/M2b/M2c, ce qui entraîne une réduction de la sécrétion d'oxyde nitrique, une expression accrue de la -synucléine et des enzymes dégradant la -amyloïde et une phagocytose accrue de la -amyloïde.

Ainsi, D-Tesa combine les propriétés d'administration bénéfiques du dendrimère avec les propriétés de commutation M1 à M2 de Tesa. En raison du rôle commun des microglies et de l'avantage thérapeutique commun d'induire un changement de phénotype M1 vers M2, D-Tesa a le potentiel de traiter de nombreux troubles neurologiques lorsqu'il est administré au bon stade de progression de la maladie.

Contributions de l'auteur

LD, AS, KL, RS, SK et RMK ont conceptualisé les expériences. LD, AS et RS ont réalisé la synthèse et la caractérisation du conjugué dendrimère-médicament. LD, KL et JJ ont réalisé les expériences cellulaires. LD et K. L. a réalisé les statistiques. LD et AS ont rédigé le manuscrit et tous les auteurs l'ont édité.

Conflits d'intérêts

RMK et SK sont co-inventeurs de l'utilisation du dendrimère à terminaison hydroxyle pour une administration ciblée aux microglies dans les maladies neurologiques, ainsi que des brevets liés à la technologie des dendrimères décrite dans cet article.

Ils sont co-fondateurs d'Ashvattha Therapeutics, Orpheris Inc. et RiniSight Inc., qui sont des sociétés qui dirigent le développement clinique de la plateforme. SK et RMK sont membres du conseil d'administration d'AshvatthaTherapeutics Inc. RS est actuellement employé par AshvatthaTherapeutics et détient des actions dans la société ; l'œuvreR. S. a joué pour cet article avant de rejoindre Ashvattha. Le conflit d'intérêts est géré par l'Université JohnsHopkins.

Remerciements

Nous tenons à remercier Elizabeth Smith Khoury pour les discussions utiles sur les expériences in vitro. Ce projet a été financé par le Patz Distinguished Professorship Endowment de JohnsHopkins et du NICHD (numéro de subvention HD076901) (RMK). Nous remercions la Wilmer Core Grant for Vision Research, Microscope, and Core Module (numéro de subvention EY001865) pour l'accès au cytomètre en flux Sony.

Nous remercions Servier Medical Arts pour l'utilisation de leur collection d'images (http://smart.servier.com/) sous licence Creative Common Attribution 3.0 Licence Générique, qui a été modifiée pour créer le résumé graphique.

Références

1 CL Gooch, E. Pracht et AR Borenstein, Le fardeau des maladies neurologiques aux États-Unis : rapport de synthèse et appel à l'action, Ann. Neurol., 2017, 81, 479-484.

2 JL Cummings, T. Morstorf et K. Zhong, Pipeline de développement de médicaments contre la maladie d'Alzheimer : peu de candidats, échecs fréquents, Alzheimer's Res. Thér., 2014, 6, 37.

3 P.-P. Liu, Y. Xie, X.-Y. Meng et J.-S. Kang, Histoire et progrès des hypothèses et des essais cliniques pour la maladie d'Alzheimer, Signal Transduction Targeted Ther., 2019, 4, 1–22.

4 C. Soto et S. Pritzkow, Mauvais repliement des protéines, agrégation et souches conformationnelles dans les maladies neurodégénératives, Nat. Neurosci., 2018, 21, 1332-1340.

5 VH Perry et C. Holmes, Amorçage microglial dans les maladies neurodégénératives, Nat. Rév. Neurol., 2014, 10, 217-224.

6 Y. Tang et W. Le, Rôles différentiels des microglies M1 et M2 dans les maladies neurodégénératives, Mol. Neurobiol., 2016, 53, 1181-1194.

7 MW Salter et B. Stevens, Microglia émergent comme des acteurs centraux dans les maladies cérébrales, Nat. Med., 2017, 23, 1018-1027.

8 S. Krasemann, et al., La voie TREM2-APOE détermine le phénotype transcriptionnel des microglies dysfonctionnelles dans les maladies neurodégénératives, Immunity, 2017, 47, 566–581.e9.

9 Q. Zhao, et al., Les effets de type antidépresseur de la pioglitazone dans un modèle murin de stress chronique léger sont associés à une altération médiée par PPAR des phénotypes d'activation microgliale, J. Neuroinflammation, 2016, 13, 259.

10 L. Wen, et al., La polarisation des microglies vers le phénotype M2 d'une manière dépendante du récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes atténue les lésions axonales induites par un traumatisme crânien chez la souris, J. Neurotrauma, 2018, 35, 2330-2340.

11 W. Cai et al., Récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes (PPAR) : un gardien principal des lésions et de la réparation du SNC, Prog. Neurobiol., 2018, 163-164, 27-58.12 B. Brakedal, et al., Utilisation de glitazone associée à un risque réduit de maladie de Parkinson, Mov. Disord., 2017, 32, 1594-1599.

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