Effets modulateurs doubles de la diosmine sur les processus de formation des calculs rénaux d'oxalate de calcium : cristallisation, croissance, agrégation, adhésion des cellules cristallines, internalisation dans les cellules tubulaires rénales et invasion par la matrice extracellulaire
Mar 16, 2022
pour plus d'informations :ali.ma@wecistanche.com
Supapoporn Khamchuna,b,c,1, Sunisa Yoodeea,1, Visite Thongboonkerda,*
aUnité de protéomique médicale, Bureau de recherche et développement, Faculté de médecine Hôpital Siriraj, Université Mahidol, Bangkok 10700, Thaïlande
bDépartement de technologie médicale, École des sciences de la santé alliées, Université de Phayao, Phayao 56000, Thaïlande
cUnité d'excellence en biomédecine moléculaire intégrative, École des sciences de la santé alliées, Université de Phayao, Phayao 56000, Thaïlande
Mots clés : Composé bioactif, Flavonoïde, Inhibiteur, Modulateur, Néphrolithiase, Promoteur, Urolithiase
ABSTRAIT
Diosmineest un glycoside de flavone naturel (bioflavonoïde) présent dans les fruits et les plantes avec plusieurs activités pharmacologiques. Il a été largement utilisé comme complément alimentaire ou agent thérapeutique dans diverses maladies/troubles. Bien que recommandée, la preuve de ses mécanismes de protection contreun reinla maladie des calculs (néphrolithiase/urolithiase), en particulier l'oxalate de calcium (CaOx) monohydraté (COM) qui est le type le plus courant, restait incertaine. Dans cette étude, nous avons donc systématiquement évalué les effets dediosmine(à 2,5–160 nM) à différents stades deun reinprocessus de formation de calculs, y compris la cristallisation COM, la croissance cristalline, l'agrégation, l'adhésion cristalline, l'internalisation dans les cellules tubulaires rénales et l'invasion par la matrice extracellulaire (ECM). Les résultats ont montré quediosmineavait des effets modulateurs dose-dépendants sur tous les processus de calculs rénaux COM mentionnés.Diosmineaugmentation significative du nombre et de la masse des cristaux COM pendant la cristallisation, mais réduction de la taille et de la croissance des cristaux. Alors quediosminefavorise l'agrégation des cristaux, il inhibe l'adhésion et l'internalisation des cellules cristallines dans les cellules tubulaires rénales. Enfin, la diosmine a favorisé l'invasion des cristaux à travers l'ECM. Nos données fournissent des preuves démontrant à la fois les effets inhibiteurs et promoteurs de la diosmine sur la COMun reinprocessus de formation de la pierre. Sur la base de ces doubles activités modulatrices de la diosmine, son rôle anti-urolithiase est douteux et des précautions doivent être prises pour son utilisation dansun reinmaladie de la pierre.
1. Introduction
Diosmine(3′,5,7-trihydroxy-4′-méthoxyflavone-7-rhamnoglucoside) est un bioflavonoïde naturel couramment présent dans diverses plantes et fruits, principalement Citrus spp. [1,2]. Il peut être synthétisé ou dérivé de l'autre flavonoïde, l'hespéridine [1,2]. La diosmine seule ou en association avec l'hespéridine est largement utilisée comme médicament phlébotrope pour le traitement des troubles veineux et lymphatiques tels que l'insuffisance veineuse chronique et les hémorroïdes [3,4]. De plus, la diosmine présente plusieurs autres activités biologiques et pharmacologiques, notamment des activités antioxydantes et anti-inflammatoires [5,6], des propriétés anti-mutagènes et anti-néoplasiques [7,8], des effets antibiotiques [9], des propriétés anti-hyperglycémiques [ 10], et des effets protecteurs contre les dommages multi-organes, c'est-à-dire,
cardiovasculaire [11], rétinien [12],un rein, lésions hépatiques et cérébrales [13].
Un reinla maladie des calculs lithiasiques (ou néphrolithiase/urolithiase) est causée par les calculs solides développés et déposés à l'intérieur du rein et affecte les humains dans toutes les régions du globe avec un taux de récidive élevé [14–17]. Parmi tous les différents cristaux responsables, l'oxalate de calcium (CaOx), en particulier la forme monohydratée (COM), est le composant cristallin le plus pathogène et le plus courant trouvé chez les formateurs de calculs (patients souffrant de calculs rénaux) [18]. Mécaniquement, les cristaux de COM ont la capacité d'adhésion la plus puissante et la plupart des effets cytotoxiques sur les cellules épithéliales tubulaires rénales [19,20]. Au cours de la pathogenèse de la pierre, le modèle de plaque de Randall et l'hypothèse intratubulaire ont des caractéristiques communes des processus de formation de la pierre COM, y compris la cristallisation, la croissance, l'agrégation, la rétention par adhérence de surface sur les cellules tubulaires rénales ou le bassinet rénal, l'internalisation dans les cellules et l'invasion dans interstitium rénal à travers la matrice extracellulaire (ECM) [21,22].
Récemment, de nombreuses études se sont concentrées sur la découverte de médicaments utilisant des plantes/fruits médicinaux et leurs composés bioactifs visant à prévenir la formation de calculs nouveaux et/ou récurrents. Un certain nombre de rapports antérieurs ont montré que certains composés bioactifs, notamment les composés phénoliques (polyphénol, flavonoïde, glycoside de flavone, etc.) extraits de plusieurs plantes/fruits médicinales, ont des effets préventifs contre les mécanismes pathogènes deun reinmaladie lithiasique à la fois in vitro et in vivo [23–25]. Parmi ces substances bénéfiques, quelques rapports ont suggéré que la diosmine pourrait empêcher le dépôt de cristaux de CaOx à l'intérieur du tissu rénal chez des modèles animaux [26,27]. Cependant, son rôle modulateur précis (inhibition ou promotion) et ses mécanismes (étapes ou processus de formation de calculs) dans la formation de calculs rénaux COM n'avaient pas été étudiés. La présente étude a donc systématiquement évalué les effets dediosmine(à 2,5–160 nM) à différents stades deun reinprocessus de formation de calculs, y compris la cristallisation, la croissance cristalline, l'agrégation, l'adhésion cristalline, l'internalisation dans les cellules tubulaires rénales et l'invasion par l'ECM.
Cliquez pourPosologie de Cistanche tubulosa pour la fonction rénale
2. Matériels et méthodes
2.1. Préparation de diosmine
Diosmine(Tokyo Chemical Industry ; Tokyo, Japon) a été dissous avec 100 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) (Sigma-Aldrich ; St. Louis, MO) et des aliquotes de travail ont été préparées aux concentrations finales de 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 et 160 nM pour étudier ses effets sur les cristaux COM. De plus, du DMSO à 100 % a été utilisé comme témoin négatif dans toutes les expériences.
2.2. Culture de cellules
La lignée de cellules épithéliales tubulaires rénales MDCK dérivée du segment tubulaire distal du néphron (ATCC ; Manassas, VA) a été propagée dans le milieu essentiel minimum d'Eagle (MEM) (Gibco ; Grand Island, NY) complété avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), 60 U/ml de pénicilline G (Sigma-Aldrich) et 60 ug/ml de streptomycine (Sigma-Aldrich). Les cellules ont été maintenues dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2 à 37 °C.
2.3. Test de cristallisation COM
La cristallisation COM a été réalisée comme décrit précédemment [28, 29]. En bref, 500 ul de CaCl2⋅2H2O 10 mM dans un tampon de cristallisation (contenant du Tris-HCl 10 mM et du NaCl 90 mM) (pH 7,4) ont été ajoutés dans chaque puits de la plaque 24-puits (Corning Inc. ; Corning, NEW YORK). Un volume égal (4 ul) de tampon de cristallisation (témoin blanc), DMSO (témoin négatif) oudiosmine(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 ou 160 nM) a été mélangé avec du CaCl2. Enfin, 500 ul de Na2C2O4 1,0 mM dans le tampon de cristallisation ont ensuite été ajoutés pour amener les concentrations finales de CaCl2 et Na2C2O4 à 5 mM et 0,5 mM, respectivement. Le mélange a été incubé à 25 ◦C pendant 1 h puis examiné. Des images de cristal ont été capturées au hasard à partir d'au moins 15 champs à haute puissance (HPF) sous un microscope à lumière à contraste de phase inversé Nikon Eclipse Ti-S (Nikon; Tokyo, Japon). La taille et le nombre de cristaux ont été mesurés à partir d'au moins 15 HPF pour chaque échantillon à l'aide du logiciel NIS Element D version 4.11 (Nikon). La masse cristalline a été calculée à partir d'au moins 100 cristaux dans 15 HPF à l'aide de la formule suivante : Masse cristalline (µm2/HPF)=Taille moyenne des cristaux dans chaque champ (µm2) × Nombre de cristaux dans chaque champ (/HPF) ( 1)
2.4. Essai de croissance cristalline COM
Le test de croissance cristalline a été effectué comme décrit précédemment [30, 31].
En bref, un volume égal (500 ul) de CaCl2⋅2H2O 10 mM et de Na2C2O4 1,0 mM dans un tampon de cristallisation a été mélangé (1:1) (v/v) dans chaque puits du { {12}}plaque à puits. Le mélange a été incubé à 25°C pendant 1 h pour permettre une cristallisation complète. A ce point (T0), un volume égal (4 ul) de tampon de cristallisation (témoin blanc), DMSO (témoin négatif) oudiosmine(2,5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 ou 160 nM) a été ajouté dans chaque puits et le mélange a été incubé pendant 60 min (T60). À T0 et T60, des images cristallines ont été capturées au hasard à partir d'au moins 15 HPF sous un microscope à lumière à contraste de phase inversé Nikon Eclipse Ti-S. Les tailles des cristaux à T0 et T60 ont été mesurées à l'aide du logiciel NIS Element D version 4.11 (Nikon), tandis que la croissance des cristaux (représentée par Δ Crystal size) a été calculée à partir d'au moins 100 cristaux dans 15 HPF en utilisant la formule suivante : Δ Crystal size (µm2)=Taille des cristaux à T60 − Taille des cristaux à T0 (2)
2.5. Test d'agrégation de cristaux COM
Le test d'agrégation de cristaux a été effectué comme décrit précédemment [32,33]. Les cristaux COM ont été générés comme mentionné ci-dessus dans le test de croissance cristalline mais avec un volume plus important dans un tube conique 50- ml (Corning Inc.), puis récoltés par centrifugation à 2000 g pendant 5 min. Le surnageant a été jeté, tandis que les cristaux de COM ont été lavés trois fois avec du méthanol. Après une nouvelle centrifugation à 2000 g pendant 5 min, le méthanol a été jeté et les cristaux ont été séchés à l'air pendant une nuit à 25 ◦C. Les cristaux de COM (1 000 µg de poids sec) ont été remis en suspension dans 1 ml de tampon de cristallisation dans chaque puits de la plaque à puits 6- (Corning Inc.). Un volume égal (4 ul) de tampon de cristallisation (témoin blanc), DMSO (témoin négatif) oudiosmine(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 ou 160 nM) a été ajouté à la suspension de cristaux COM dans chaque puits. La plaque a été agitée en continu dans un incubateur à agitation (Zhicheng; Shanghai, Chine) à 150 tr/min et 25 ◦C pendant 1 h. Par la suite, la formation d'un agrégat de cristaux COM (défini comme "un assemblage de trois cristaux COM individuels ou plus étroitement liés" [32]) a été examinée et imagée au microscope à lumière à contraste de phase inversé Nikon Eclipse Ti-S. Le nombre d'agrégats de cristaux COM a été compté à partir d'au moins 15 HPF aléatoires par puits.
2.6. Test d'adhérence des cellules cristallines COM
Le test d'adhérence des cellules cristallines a été effectué comme décrit précédemment [34, 35]. En bref, des cristaux de COM ont été générés comme mentionné ci-dessus dans un tube conique de 50- ml, puis récoltés par centrifugation à 2000 g pendant 5 min. Le surnageant a été jeté, tandis que les cristaux de COM ont été lavés trois fois avec du méthanol. Après une nouvelle centrifugation à 2000 g pendant 5 min, le méthanol a été jeté et les cristaux ont été séchés à l'air pendant une nuit à 25 ◦C. Les cristaux ont été décontaminés par rayonnement UV pendant 30 min avant intervention sur les cellules.
Des cellules MDCK (à une densité de 2 × 105 cellules / puits) ont été ensemencées et cultivées dans chaque puits de la plaque à puits 6- (Corning Inc.) pendant 48 h pour obtenir une monocouche confluente. Le milieu de culture a ensuite été rafraîchi avant d'ajouter des cristaux de COM (100 µg de cristaux en poids sec par ml de milieu de culture). Un volume égal (4 ul) de tampon de cristallisation (témoin blanc), DMSO (témoin négatif) oudiosmine(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 ou 160 nM) a été ajouté dans chaque puits. Les cellules ont ensuite été incubées dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2 à 37 °C pendant 1 h. Ensuite, les cellules ont été vigoureusement lavées avec du PBS cinq fois et imagées sous un microscope à lumière à contraste de phase inversé Nikon Eclipse Ti-S. Le nombre de cristaux COM restants adhérant à la surface des cellules tubulaires rénales a été compté à partir d'au moins 15 champs aléatoires par puits.
Cistanche pour la fonction rénale
2.7. Test d'internalisation des cristaux COM
Les cristaux COM marqués par fluorescence ont été générés comme décrit précédemment [36,37]. Les compositions/concentrations des produits chimiques utilisés pour la cristallisation étaient les mêmes que celles mentionnées ci-dessus pour les cristaux simples (non marqués), mais 0.1 µg/ml d'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (Thermo Scientific Pierce ; Rockford, IL) était ajouté à la solution CaCl2⋅2H2O avant le mélange avec Na2C2O4. Les étapes suivantes (cristallisation et récolte) ont été effectuées comme mentionné ci-dessus, mais dans l'obscurité.
Pour évaluer l'internalisation des cristaux dans les cellules épithéliales tubulaires rénales, des cellules MDCK (à une densité de 2 × 105 cellules/puits) ont été ensemencées et cultivées dans chaque puits de la plaque à puits 6- (Corning Inc.) pendant 48 h pour obtenir monocouche confluente. La monocouche cellulaire a été incubée avec des cristaux COM marqués au FITC (1 000 µg cristal/ml de milieu) dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2 à 37 °C pendant 1 h. Ensuite, les cellules ont été lavées avec du PBS et incubées avec une solution de trypsine-EDTA pour éliminer les cristaux non intériorisés (à la fois adhérents et non adhérents). Le pourcentage de cellules avec des cristaux intériorisés a été quantifié à partir d'un total de 10 000 événements acquis à l'aide d'un cytomètre en flux (BD Accuri C6) (BD Biosciences ; San Jose, CA). Les cellules incubées avec des cristaux COM simples (non marqués) ont été utilisées pour prérégler le bruit et le seuil du signal de fluorescence positif. Les cellules avec des signaux de fluorescence positifs ont ensuite été comptées et utilisées pour un tel calcul de pourcentage.
2.8. Invasion de cristaux COM par dosage ECM
Les cristaux de COM ont été préparés comme décrit ci-dessus pour les tests d'agrégation de cristaux et d'adhérence cristal-cellule. Le test d'invasion de cristaux a été réalisé selon le protocole établi précédemment [38,39]. En bref, un total de 20 µg de cristaux COM recouverts de tampon de cristallisation (témoin blanc), de DMSO (témoin négatif), d'albumine (Sigma-Aldrich) (témoin positif) oudiosmine(2,5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 ou 160 nM) ont été ajoutés dans 200 ul de MEM. Ensuite, 200 ul de Lys-plasminogène 0,3 pM (Fitzgerald Industries international; Acton, MA) dans du PBS ont été mélangés et incubés avec le complexe cristal-protéine à 37 °C pendant 1 h. Le plasminogène non lié a été jeté par centrifugation à 2000 g pendant 5 min et le culot a été lavé avec du PBS une fois. Ensuite, 100 ul de 0,15 pM d'activateur de plasminogène d'urokinase (uPA) (Fitzgerald Industries International) dans du PBS ont été mélangés avec le complexe cristal-protéine-plasminogène/plasmine. Le mélange a ensuite été ajouté au-dessus du gel matriciel à l'intérieur de la chambre de migration ECM et incubé à 37 ◦C. Après 24-h d'incubation, la solution restée sur la partie supérieure de la chambre de migration a été retirée à l'aide d'une gaze ou d'un papier de soie. Les cristaux de COM envahis à l'intérieur du gel de la matrice ont ensuite été imagés à l'aide d'un microscope optique avec mode de contraste interférentiel différentiel (DIC) (Nikon H600L). La distance d'invasion cristalline a été mesurée et moyennée à partir d'au moins 15 champs de faible puissance (LPF) dans la même chambre à l'aide du logiciel NIS Element D version 4.11 (Nikon).
2.9. analyses statistiques
Toutes les expériences ci-dessus ont été réalisées en triple (trois expériences indépendantes) et les données quantitatives sont rapportées en moyenne ± SEM. Des comparaisons multiples ont été effectuées à l'aide d'une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) avec le test post-hoc de Tukey. Le test de corrélation de Pearson a été réalisé pour déterminer la relation entre les variables. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel SPSS (version 18) (IBM SPSS ; Armonk, NY). Une valeur P inférieure à 0.05 a été considérée comme statistiquement significative.
3. Résultats
3.1. Effet de la diosmine sur la cristallisation COM
La cristallisation est l'une des premières étapes essentielles deun reinprocessus de formation de pierre de tous types. Après 1-h de cristallisation avec ou sansdiosmineà diverses concentrations (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 ou 160 nM), la taille et le nombre de cristaux COM ont été mesurés et la masse cristalline a été calculée. Le tampon de cristallisation et le diluant DMSO ont servi respectivement de témoins à blanc et négatifs. Les données ont montré que toutes les doses (2, 5 à 160 nM) de disomine réduisaient considérablement la taille des cristaux mais augmentaient le nombre de cristaux de manière dose-dépendante par rapport aux témoins vierges et négatifs (Fig. 1A – 1C). En concordance avec le nombre de cristaux, la masse cristalline a augmenté en fonction de la dose (Fig. 1D). Globalement, ces données indiquent que la diosmine favorise la cristallisation des COM (néocristaux).
3.2. Effet de la diosmine sur la croissance des cristaux COM
L'effet modulateur dediosminesur la croissance des cristaux de COM a été évaluée en mesurant le changement de la taille des cristaux (taille des cristaux Δ) après 60- min d'incubation supplémentaire après l'achèvement de l'étape de cristallisation initiale, lorsque les néocristaux étaient absents. Les résultats ont démontré que toutes les doses (2, 5 à 160 nM) de disomine réduisaient considérablement la taille des cristaux Δ de manière dose-dépendante par rapport aux témoins vierges et négatifs (Fig. 2). Ces découvertes indiquent que la diosmine inhibe la croissance des cristaux de COM.
3.3. Effet de la diosmine sur l'agrégation des cristaux COM
En plus de la croissance cristalline, l'agrégation de cristaux individuels qui adhèrent étroitement ensemble est une autre étape importante au cours deun reinpathogenèse de la pierre. Le degré élevé d'agrégation de cristaux peut finalement conduire à une hypertrophie des calculs et à une obstruction de la petite lumière tubulaire rénale. En comparant avec des témoins blancs et négatifs,diosmineà 10–160 nM, nombre accru d'agrégats de cristaux COM en fonction de la dose (Fig. 3). Ces résultats indiquent que la diosmine favorise l'agrégation des cristaux de COM.
Cistanche pour la fonction rénale
3.4. Effet de la diosmine sur l'adhésion des cellules cristallines COM
La rétention des cristaux responsables est l'une des étapes cruciales pourun reinla formation de calculs et peut être induite par l'adhérence des cellules cristallines qui empêche les cristaux de s'expulser avec l'écoulement de l'urine. Nous avons ainsi évalué l'activité modulatrice dediosminesur l'adhérence des cellules cristallines COM. Les données ont révélé que la diosmine à 5–160 nM réduisait de manière significative la capacité d'adhérence des cristaux de COM sur les cellules tubulaires rénales de manière dose-dépendante par rapport aux témoins blancs et négatifs (Fig. 4). Ces données indiquent que la diosmine inhibe l'adhésion des cellules cristallines COM.
3.5. Effet de la diosmine sur l'internalisation des cristaux COM dans les cellules tubulaires rénales
Après adhésion, certains cristaux de COM peuvent être internalisés dans les cellules tubulaires rénales et provoquer plusieurs réponses cellulaires ultérieures [37,40]. L'internalisation des cristaux a été évaluée en utilisant des cristaux COM marqués au FITC et quantifiée par cytométrie en flux. Des cristaux COM simples (sans marquage) ont été utilisés pour soustraire le bruit technique et pour s'assurer que l'intensité de fluorescence provenait du signal FITC. En comparaison avec les contrôles blancs et négatifs, le pourcentage de cellules avec des cristaux intériorisés a été significativement diminué pardiosmineà 10–160 nM de manière dose-dépendante (Fig. 5). Les résultats indiquent que la disomine inhibe l'internalisation des cristaux de COM dans les cellules tubulaires rénales.
3.6. Effet de la diosmine sur l'invasion des cristaux COM par ECM
L'invasion de cristaux par l'ECM est un processus pathogène / destructeur au cours deun reinla pathogenèse des calculs qui peut déclencher diverses réponses et cascades inflammatoires, aggravant ainsi les mécanismes de la maladie. Nous avons examiné ce phénomène en utilisant un protocole établi basé sur l'activité plasminogène-plasmine du complexe cristal-protéine [38,39]. Les résultats ont montré que toutes les doses de disomine (2, 5 à 160 nM) augmentaient de manière significative l'invasion des cristaux de COM à travers l'ECM de manière dose-dépendante (Fig. 6). De façon intéressante,diosmineà 160 nM pourrait favoriser l'invasion des cristaux de COM comparable à l'albumine, qui est le puissant promoteur connu de l'invasion des cristaux de COM [41] (Fig. 6). Ces résultats indiquent que la diosmine favorise fortement l'invasion des cristaux de COM à travers l'ECM.
Fig. 1. Effet dediosminesur la cristallisation COM. Le test de cristallisation a été effectué avec un volume égal (4 ul) de tampon de cristallisation (témoin blanc), de DMSO (témoin négatif) ou de diosmine (2,5 à 160 nM). (A) : morphologie cristalline dans chaque condition après 1-h cristallisation. Le grossissement original était de 400× pour tous les panneaux. (B) : Taille des cristaux. (C) : numéro de cristal. (D) : la masse cristalline (voir la formule 1 dans "Matériels et méthodes") a été analysée à partir d'au moins 100 cristaux dans 15 HPF. Chaque barre représente la moyenne ± SEM des données dérivées de 3 expériences indépendantes. * = p< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" dmso.="">
Fig. 2. Effet dediosminesur la croissance des cristaux de COM. Le test de croissance cristalline a été effectué une fois la cristallisation terminée (pour éviter la néocristallisation) avec un volume égal (4 ul) de tampon de cristallisation (contrôle à blanc), de DMSO (contrôle négatif) ou de diosmine (2, 5 à 16 0 nM). (A) : Morphologie cristalline dans chaque condition à T0 et T60. Le grossissement d'origine était de 400 × pour tous les panneaux. (B)-(J) : histogrammes de tailles de cristaux mesurés à partir de cristaux individuels à T0 et T60 dans chaque groupe. (K) : Δ La taille des cristaux (voir la formule 2 dans "Matériels et méthodes") a été analysée à partir d'au moins 100 cristaux dans 15 HPF. Chaque barre représente la moyenne ± SEM des données dérivées de 3 expériences indépendantes. *= p < 0,05 par="" rapport="" au="" contrôle="" à="" blanc ;="" #="p">< 0,05 par="" rapport="" au="">
Fig. 3. Effet dediosminesur l'agrégation de cristaux COM. Le test d'agrégation des cristaux a été effectué avec un volume égal (4 ul) de tampon de cristallisation (contrôle à blanc), de DMSO (contrôle négatif) ou de diosmine (2, 5 à 160 nM). (A) : Micrographies des cristaux COM agrégés (étiquetés avec des cercles en pointillés). Le grossissement original était de 400 × pour tous les panneaux. (B) : Le nombre d'agrégats de cristaux a été compté à partir d'au moins 15 HPF aléatoires dans chaque puits. Chaque barre représente la moyenne ± SEM des données dérivées de 3 expériences indépendantes. *=p< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="" dmso.="">
Fig. 4. Effet dediosminesur l'adhérence des cellules cristallines COM. Le test d'adhérence des cellules cristallines a été effectué avec un volume égal (4 ul) de tampon de cristallisation (témoin blanc), de DMSO (témoin négatif) ou de diosmine (2, 5 à 160 nM). (A) : Micrographies des cristaux restants qui adhèrent étroitement à la monocouche cellulaire après avoir retiré les cristaux non liés par des lavages vigoureux avec du PBS. Le grossissement original était de 200 × pour tous les panneaux. (B) : le nombre de cristaux collés a été compté à partir d'au moins 15 champs aléatoires dans chaque puits. Chaque barre représente la moyenne ± SEM des données dérivées de 3 expériences indépendantes. *= p<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p"><0.05 vs.="">
Fig. 5. Effet dediosminesur l'internalisation des cristaux de COM dans les cellules tubulaires rénales. Le test d'internalisation des cristaux a été effectué à l'aide de cristaux COM marqués au FITC (FITC-COM), tandis que les cristaux COM simples (non marqués) ont été utilisés pour la soustraction de fond/bruit. Le test a été effectué avec un volume égal (4 ul) de tampon de cristallisation (témoin blanc), de DMSO (témoin négatif) ou de diosmine (2,5–160nM). (A) : analyse par cytométrie en flux de la taille (axe y) et de l'intensité de fluorescence FITC (axe x) des cellules après élimination des cristaux non intériorisés avec 0,1 % de trypsine/2,5 mM d'EDTA. (B) : Pourcentage des cellules avec des cristaux COM intériorisés marqués au FITC. Chaque barre représente la moyenne ± SEM des données dérivées de 3 expériences indépendantes. *= p<0.05 vs.="" fitc-com="" +="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" fitc-com="" +="" dmso.="">
Fig. 6. Effet dediosminesur l'invasion de cristaux COM à travers l'ECM. L'invasion des cristaux par le test ECM a été réalisée à l'aide de cristaux COM recouverts d'un tampon de cristallisation (contrôle à blanc), de DMSO (contrôle négatif), d'albumine (contrôle positif) ou de diosmine (2, 5 à 160 nM). (A) : Micrographies des cristaux COM envahis ou migrés à travers la chambre de migration ECM. Le grossissement original était de 100 × pour tous les panneaux. (B) : La distance d'invasion de cristal a été mesurée à partir d'au moins 15 LPF aléatoires dans chaque chambre. Chaque barre représente la moyenne ± SEM des données dérivées de 3 expériences indépendantes. *= p<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="">
4. Discussion
La maladie des calculs rénaux est causée par la formation de calculs à l'intérieur duun reinet système pelvocalyceal. Les processus courants de formation de calculs rénaux comprennent la cristallisation, la croissance, l'agrégation, la rétention par l'adhésion des cellules cristallines et l'invasion par l'interstitium rénal riche en ECM [21,22]. Il existe plusieurs tentatives pour prévenir cette maladie en utilisant une variété de médicaments et/ou de suppléments nutritionnels. De nombreuses sources de données récentes ont rapporté que les flavonoïdes, les glycosides de flavone et d'autres composés extraits d'agrumes peuvent avoir des effets préventifs sur la maladie des calculs rénaux et d'autres troubles [23-25]. Parmi ceux-ci,diosmine, un glycoside de flavone naturel et un dérivé d'hespéridine que l'on trouve principalement dans les agrumes [1,2], a été suggéré de jouer un rôle préventif contre les blessures et les dommages deun reintissus [13,42]. De plus, son rôle anti-urolithiase a été rapporté dans quelques études antérieures utilisant des modèles animaux [26,27]. Néanmoins, les effets bénéfiques et les mécanismes sous-jacents de la diosmine dans la prévention des calculs rénaux sont restés flous. Nous avons ainsi examiné l'activité modulatrice de la diosmine sur les cristaux de COM. Les analyses systématiques ont été faites sur différentes étapes de COMun reinla formation de calculs, y compris la cristallisation, la croissance cristalline, l'agrégation, l'adhésion des cellules cristallines, l'internalisation dans les cellules tubulaires rénales et l'invasion par l'ECM.
Après prise orale dediosmine, sa concentration plasmatique chez l'homme varie de {{0}},5 à 200 ng/ml (ou 0,8 à 300 nM) [43,44]. La concentration plasmatique maximale (Cmax) est d'environ 50ng/ml (ou 85nM) [43,44]. Par conséquent, les doses de diosmine utilisées dans notre présente étude (2,5 à 160 nM) se situaient dans la plage pharmacologiquement pertinente pour sa pharmacocinétique. Étant donné que le DMSO a été utilisé comme diluant pour dissoudre complètement la diosmine conformément aux recommandations, le DMSO a été utilisé comme témoin négatif dans cette étude en plus du témoin à blanc pour s'assurer qu'il n'y avait aucun effet du diluant lui-même qui pourrait interférer avec l'interprétation des données. Dans tous les tests, les données ont montré qu'il n'y avait pas d'effets significatifs du DMSO observés et toutes les données quantitatives dérivées du contrôle négatif étaient comparables à celles du contrôle à blanc.
Le test de cristallisation COM a révélé que toutes les concentrations dediosmine(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 et 160 nM) pourraient réduire la taille des cristaux COM mais, d'autre part, augmenter le nombre de cristaux. Comme la masse cristalline est le produit final de la taille et du nombre de cristaux et est plus pertinente pour refléter le degré de cristallisation COM, nous avons ensuite évalué si la diosmine affectait cet indice cristallin. Les données ont montré que toutes les concentrations de diosmine avaient un effet promoteur sur la masse cristalline COM, conformément aux données sur le nombre de cristaux. Après la cristallisation, les cristaux COM peuvent encore croître à la plus grande taille pour la prochaine étape deun reinformation de pierres.
Contrairement à la cristallisation, la diosmine à toutes les concentrations a présenté l'effet inhibiteur sur la croissance des cristaux de COM de manière dose-dépendante. Certaines études antérieures ont rapporté que la solubilité des cristaux de CaOx peut être augmentée par des dérivés d'hydroxyanthraquinones avec glycosylation [45]. De plus, la présence de sucres dans de tels composés bioactifs peut se lier à l'ion calcium libre, probablement en raison des groupes hydroxyle dans la structure moléculaire, inhibant ainsi la formation de cristaux de CaOx [45,46]. La diosmine pourrait également affecter la transition des ions calcium et oxalate solubilisés dans les particules cristallines COM dans le liquide tubulaire rénal dans le processus de cristallisation COM basé sur ce mécanisme.
Néanmoins, l'agrégation des cristaux COM a été favorisée par 10–160 nMdiosmine, impliquant la capacité de la diosmine à agir comme un lieur ou une molécule adhésive pour recruter des cristaux individuels pour se lier ensemble pour former les agrégats de cristaux. Cette liaison entraîne également la progression de ponts adhésifs entre les cristaux individuels et peut induire la formation d'une grande structure de cristaux COM, qui contribuent facilement au dépôt de nidus de pierre à l'intérieur duun rein[32].
La rétention des cristaux de COM par l'adhésion des cristaux sur les surfaces des cellules tubulaires rénales a été établie comme une autre étape importante pour la formation de calculs rénaux [47]. Nos données ont révélé que la diosmine pouvait réduire la capacité adhésive des cristaux COM à se lier aux surfaces apicales des cellules tubulaires rénales MDCK. Certaines études antérieures ont montré que les glycosaminoglycanes (composés polysaccharidiques) enrobés sur des cristaux de CaOx ou exprimés sur des cellules tubulaires rénales peuvent interférer avec la capacité d'adhérence des cristaux de CaOx sur les cellules tubulaires rénales [48]. De plus, l'expression des récepteurs cristallins sur les cellules tubulaires rénales est l'un des mécanismes cruciaux déterminant l'adhésion des cellules cristallines [21]. Alors que les cristaux de CaOx induisent des lésions des membranes apicales, en particulier des microvillosités, certains polyphénols tels que le gallate d'épigallocatéchine (EGCG) peuvent empêcher l'adhérence des cellules cristallines et les lésions cellulaires [49]. De plus, il a déjà été rapporté que la substance flavonoïde dans divers extraits de plantes augmentait le niveau de pH urinaire, conduisant à l'inhibition de l'adhésion des cellules cristallines [50,51]. Peut-être,diosminepourrait également atténuer une telle lésion cellulaire induite par la COM, réduisant ainsi l'adhérence des cellules cristallines.
Il a été démontré que l'internalisation des cristaux de COM apparaît principalement par endocytose via la voie de macropinocytose médiée par le cytosquelette d'actine [40]. Il a été rapporté que les flavonoïdes tels que la quercétine affectent le cytosquelette d'actine nécessaire à la macropinocytose [52,53]. Nos résultats ont montré que la diosmine réduisait considérablement la capacité des cellules MDCK à internaliser les cristaux COM. Un tel effet inhibiteur de la diosmine pourrait être associé à l'assemblage ou à l'organisation du cytosquelette d'actine à l'intérieur des cellules qui affecte directement la voie de la macropinocytose [54,55].
Après internalisation, les cristaux de COM ont été dégradés par les endolysosomes entraînant une augmentation des ions calcium et oxalate libres dans l'interstitium rénal [37]. De telles augmentations des ions calcium et oxalate peuvent conduire à une néocristallisation de COM dans l'interstitium rénal [56,57]. De plus, la présence de cristaux de COM interstitiels peut provenir de défauts de barrières de jonction serrée et d'adhésion paracellulaire, entraînant une augmentation de la perméabilité paracellulaire et de la translocation des cristaux [58–60]. Ces cristaux peuvent alors envahir l'interstitium rénal à travers l'ECM et déclencher par la suite plusieurs réponses inflammatoires et lésions tissulaires [58–60]. Dans cette étude, nous avons observé que l'invasion des cristaux COM à travers la chambre de migration ECM était induite par toutes les concentrations de diosmine. La diosmine pourrait se lier aux surfaces cristallines COM et interagir avec le système plasminogène-plasmine qui a conduit la migration des cristaux dans la chambre de migration ECM [38,39].
Cistanche pour rein
Cardiosmineinduit à la fois des effets inhibiteurs et promoteurs sur différents processus de formation de calculs COM, nous avons donc déterminé leur relation à l'aide du test de corrélation de Pearson. L'analyse de corrélation a révélé que le nombre de cristaux était inversement corrélé à la fois à la taille des cristaux et à la croissance des cristaux (taille des cristaux Δ) (Fig. 7A et B). La taille des cristaux est fortement corrélée à la croissance cristalline (Fig. 7C) mais inversement corrélée à la masse cristalline (Fig. 7D). Enfin, la masse cristalline est fortement corrélée à la fois au nombre de cristaux et à l'agrégation de cristaux (Fig. 7E et F). D'après l'analyse de corrélation, les données indiquent que le nombre de cristaux et la masse de cristaux sont plus pertinents pour refléter la cristallisation que la taille des cristaux (Fig. 7A, D et E). De plus, la taille des néocristaux pendant la cristallisation est liée à la croissance des cristaux préformés (Fig. 7C), tandis que le degré de cristallisation (tel que reflété par le nombre de cristaux et la masse cristalline) est étroitement lié au degré d'agrégation des cristaux (Fig. 7E et F). Cependant, ces corrélations sont très probablement spécifiques aux effets de la diosmine, alors que les effets d'autres modulateurs peuvent ou non avoir les mêmes corrélations. Par exemple, la fibronectine diminue la masse cristalline et inhibe la croissance cristalline, mais favorise l'agrégation des cristaux [31]. De plus, Escherichia coli intact et viable augmente la taille et la masse des cristaux mais n'a aucun effet sur le nombre de cristaux [33]. Ces données indiquent que les corrélations entre les différents dosages de cristaux COM ne sont pas universelles pour tous les modulateurs.
Enfin, nous avons résumé les résultats obtenus à partir de différents tests et les avons intégrés aux mécanismes pathogéniques deun reinmaladie lithiasique (voir schémas de la Fig. 8). D'après l'analyse de corrélation, la diosmine favorise la cristallisation (Fig. 8A). Entre cristallisation et croissance cristalline,diosminemaintient un bon équilibre en favorisant la cristallisation mais, d'autre part, en inhibant la croissance cristalline (Fig. 8B). Concernant tous les effets sur les cristaux COM seuls (sans tenir compte des cellules et de l'ECM qui interviennent également), l'activité promatrice de la diosmine est plus importante que son activité inhibitrice sur les cristaux COM car elle favorise à la fois la cristallisation et l'agrégation des cristaux, mais n'inhibe que la croissance des cristaux ( figure 8C). Bien que la cristallisation augmente, la taille des cristaux diminue et est associée à l'inhibition de la croissance (Fig. 7C). Ces données sont cohérentes avec les résultats rapportés par Kavanagh et al. [61–63], démontrant que l'augmentation de la cristallisation conduit à la diminution de la sursaturation des ions calcium et oxalate dans la solution, diminuant ainsi la croissance. Cependant, la croissance cristalline n'est pas le seul facteur déterminant laun reinla pathogenèse des calculs [64], en particulier lorsque la masse cristalline déborde et est associée à l'augmentation de l'agrégation cristalline (Fig. 7F) qui peut augmenter le risque que les matériaux cristallins se coincent dans de petits segments tubulaires (dans l'hypothèse intratubulaire), augmentant ainsi le risque de formation de pierres. De plus, une étude précédente a montré des données cohérentes avec nos résultats, indiquant que l'augmentation du nombre de cristaux est associée à l'augmentation de l'agrégation des cristaux et à l'élargissement de la pierre [63].
Fig. 7. Analyse des corrélations. (A) – (F) : les corrélations entre le nombre de cristaux COM, la taille des cristaux, la taille des cristaux Δ, la masse des cristaux et un certain nombre d'agrégats de cristaux ont été analysées par le test de corrélation de Pearson.
Fig. 8. Schémas résumant les effets modulateurs dediosminesur COMun reinprocessus de formation de la pierre. (A) : Effets de la diosmine sur la cristallisation COM. (B) : Effets de la diosmine sur la cristallisation COM et la croissance cristalline. (C) : effets de la diosmine sur la cristallisation, la croissance et l'agrégation des COM. (D) : Effets de la diosmine sur l'ensemble des processus de formation des calculs rénaux COM.
Lorsque les interactions avec les cellules tubulaires rénales et l'ECM sont prises en compte, l'image globale des effets doubles dediosminesur COM, la formation de calculs rénaux devient beaucoup plus claire (Fig. 8D). La diosmine inhibe l'adhésion des cellules cristallines, réduisant ainsi l'internalisation des cristaux dans les cellules. Cela peut s'expliquer par le fait que la plus petite taille des cristaux COM a moins de capacité adhésive pour lier les cellules tubulaires rénales par rapport aux plus grandes, comme indiqué dans notre étude récente [34] et une étude précédente par un autre groupe [65]. La moindre capacité adhésive des cristaux COM plus petits est due à leur force d'adhérence moindre à la surface cellulaire et au nombre réduit de récepteurs cristallins COM qui leur sont liés, comme déterminé par microscopie à force atomique et analyse du protéome, respectivement [34]. La diosmine inhibe également l'internalisation des cristaux. Notez que le processus d'intériorisation est une arme à double tranchant qui nécessite une interprétation prudente. L'internalisation ou endocytose dans l'un des mécanismes de défense que les cellules utilisent pour l'élimination des cristaux par les endolysosomes. Cependant, la dégradation des cristaux intacts génère des ions calcium et oxalate libres qui peuvent se déplacer du compartiment intracellulaire vers l'interstitium rénal, où ils peuvent générer des néocristaux [56,57]. D'autre part, la diosmine favorise l'invasion des cristaux par l'ECM, qui est l'un des mécanismes importants pour la pathogenèse des calculs rénaux (en particulier dans le modèle de plaque de Randall) [58–60]. Dans l'ensemble, la figure 8D résume tous les effets modulateurs doubles de la diosmine sur COMun reinprocessus de formation de la pierre. Il est à noter que la balance de ces effets promoteurs et inhibiteurs ne peut être calculée précisément (contrairement à une équation mathématique). De plus, il existe plusieurs autres facteurs endogènes et exogènes qui peuvent également intervenir dans les processus de formation de la pierre. Enfin, la diosmine présente également plusieurs effets indirects sur la formation des calculs rénaux, dont ses propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires [5,6] dont il faut tenir compte. Par conséquent, le résultat final de ces doubles effets modulateurs dediosminesur COMun reinla formation de calculs nécessite une enquête in vivo plus approfondie et une étude prospective sur une grande cohorte.
5. Conclusions
En résumé, nous rapportons ici les effets doubles de la diosmine sur la modulation des cristaux de COM d'une manière dose-dépendante. Bien qu'il inhibe la croissance des cristaux de COM, l'adhésion des cellules cristallines et l'internalisation dans les cellules tubulaires rénales,diosminefavorise la cristallisation, l'agrégation et l'invasion COM à travers l'ECM. Par conséquent, son rôle anti-urolithiase est douteux et des précautions doivent être prises pour son utilisation dans la maladie des calculs rénaux.
Déclaration de contribution de la paternité du CRediT
Supaporn Khamchun : Conceptualisation, Méthodologie, Logiciel, Validation, Analyse formelle, Enquête, Curation des données, Rédaction – projet original, Visualisation, Sunisa Yoodee : Conceptualisation, Méthodologie, Logiciel, Validation, Analyse formelle, Enquête, Curation des données, Rédaction – projet original, Visualisation, Visitez Thongboonkerd : Conceptualisation, Méthodologie, Logiciel, Validation, Ressources, Rédaction – révision & édition, Supervision, Administration de projet, Acquisition de financement.
Déclaration de conflit d'intérêts
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.
Remerciements
Nous sommes reconnaissants pour l'assistance technique de Kittiya Suwannakud. Ce travail a été soutenu par l'Office of National Higher Education Science Research and Innovation Policy Council (NXPO) via PMU-B et le Thailand Research Fund (IRN60W0004). VT est également soutenu par la subvention "Chalermphrakiat", Faculté de médecine de l'hôpital Siriraj.
Références
[1] A. Bogucka-Kocka, M. Wozniak, M. Feldo, J. Kockic, K. Szewczyk,Diosmine– techniques d'isolement, détermination dans le matériel végétal et les formulations pharmaceutiques, et utilisation clinique, Nat. Prod. Commun. 8 (2013) 545–550.
[2] Y. Zheng, R. Zhang, W. Shi, L. Li, H. Liu, Z. Chen, L. Wu, Métabolisme et activités pharmacologiques de la diosmine, un composé naturel bénéfique pour la santé, Food Funct. 11 (2020) 8472–8492.
[3] MR Cesarone, G. Belcaro, L. Pellegrini, A. Ledda, G. Vinciguerra, A. Ricci, A. Di Renzo, I. Ruffini, G. Gizzi, E. Ippolito, F. Fano, M. Dugall , G. Acerbi, U. Cornelli, M. Hosoi, M. Cacchio, Venoruton vs Daflon : évaluation des effets sur la qualité de vie dans l'insuffisance veineuse chronique, Angiology 57 (2006) 131–138.
[4] KA Lyseng-Williamson, CM Perry, Fraction flavonoïde purifiée micronisée: examen de son utilisation dans l'insuffisance veineuse chronique, les ulcères veineux et les hémorroïdes, Drugs 63 (2003) 71–100.
[5] AS Shalkami, M. Hassan, AG Bakr, Anti-inflammatoire, l'activité antioxydante et anti-apoptotique de la diosmine dans la colite ulcéreuse induite par l'acide acétique, Hum. Exp. Toxicol. 37 (2018) 78–86.
[6] M. Berkoz, Diosmin supprime les médiateurs pro-inflammatoires dans les macrophages RAW264.7 induits par les lipopolysaccharides via les voies de signalisation NF-kappaB et MAPKs, Gen. Physiol. Biophys. 38 (2019) 315–324.
[7] M. Rajasekar, K. Suresh, K. Sivakumar, la diosmine induit l'apoptose par la modulation de la signalisation STAT-3 dans la carcinogenèse de la poche buccale induite par le 7,12 diméthylbenz(a)anthracène, Biomed. Pharm. 83 (2016) 1064-1070.
[8] A. Lewinska, J. Adamczyk-Grochala, E. Kwasniewicz, A. Deregowska, M. Wnuk, Sénescence, apoptose et autophagie induites par la diosmine dans des cellules cancéreuses du sein de statut p53 et d'activité ERK différents, Toxicol. Lett. 265 (2017) 117-130.
[9] AC Pushkaran, V. Vinod, M. Vanuopadath, SS Nair, SV Nair, AK Vasudevan, R. Biswas, CG Mohan, La combinaison de la diosmine, un médicament réutilisé, avec l'amoxicilline-acide clavulanique provoque une inhibition synergique de la croissance mycobactérienne, Sci. Rép. 9 (2019) 6800.
[10] CC Hsu, MH Lin, JT Cheng, MC Wu, L'action antihyperglycémique de la diosmine, un flavonoïde d'agrumes, est induite par la bêta-endorphine endogène chez les rats diabétiques de type I, Clin. Exp. Pharm. Physiol. 44 (2017) 549–555.
[11] O. Senthamizhselvan, J. Manivannan, T. Silambarasan, B. Raja,Diosminele prétraitement améliore la fonction cardiaque et supprime le stress oxydatif dans le cœur du rat après ischémie/reperfusion, Eur. J.Pharm. 736 (2014) 131–137.
[12] N. Tong, Z. Zhang, Y. Gong, L. Yin, X. Wu, Diosmin protège la rétine du rat contre les lésions d'ischémie/reperfusion, J. Ocul. Pharm. Là. 28 (2012) 459–466.
[13] AE Elhelaly, G. AlBasher, S. Alfarraj, R. Almeer, EI Bahbah, MMA Fouda, SG Bungau, L. Aleya, MM Abdel-Daim, Effets protecteurs de l'hespéridine et de la diosmine contre le foie, les reins, et dommages oxydatifs au cerveau chez le rat, Environ. Sci. Pollution. Rés. Int. 26 (2019) 35151–35162.
[14] C. Thongprayoon, AE Krambeck, AD Rule, Détermination du véritable fardeau deun reinmaladie de la pierre, Nat. Rév. Néphrol. 16 (2020) 736–746.
[15] K. Bishop, T. Momah, J. Ricks, Néphrolithiase, Prim. Soins 47 (2020) 661–671.
[16] A. Viljoen, R. Chaudhry, J. Bycroft, Calculs rénaux, Ann. Clin. Biochem 56 (2019) 15–27.
[17] PM Ferraro, R. Marano, A. Primiano, J. Gervasoni, M. Bargagli, G. Rovere, PF Bassi, G. Gambaro, Composition de la pierre et calcifications vasculaires chez les patients atteints de néphrolithiase, J. Nephrol. 32 (2019) 589–594.
[18] G. Schubert, Analyse de pierre, Urol. Rés. 34 (2006) 146-150.
[19] A. Vinaiphat, S. Aluksanasuwan, J. Manissorn, S. Sutthimethakorn, V. Thongboonkerd, Réponse des cellules tubulaires rénales aux différents types et doses de cristaux d'oxalate de calcium : analyse intégrative du réseau protéomique et investigations fonctionnelles, Protéomique 17 (2017 ), 1700192.
[20] P. Peerapen, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Analyse du réseau protéique et études fonctionnelles de la cytotoxicité induite par les cristaux d'oxalate de calcium dans les cellules épithéliales tubulaires rénales, Proteomics 18 (2018), 1800008.
[21] KP Aggarwal, S. Narula, M. Kakkar, C. Tandon, Néphrolithiase : mécanisme moléculaire de la formation de calculs rénaux et rôle critique joué par les modulateurs, Biomed. Rés. Int. 2013 (2013), 292953.
[22] VN Ratkalkar, JG Kleinman, Mécanismes de formation de pierre, Clin. Le révérend Bone Miner. Métab. 9 (2011) 187–197.
[23] X. Zeng, Y. Xi, W. Jiang, Rôles protecteurs des flavonoïdes et des extraits de plantes riches en flavonoïdes contre la lithiase urinaire : une revue, Crit. Rev Food Sci. Nutr. 59 (2019) 2125-2135.
[24] MC Nirumand, M. Hajialyani, R. Rahimi, MH Farzaei, S. Zingue, SM Nabavi, A. Bishayee, Les plantes diététiques pour la prévention et la gestion desun reincalculs : preuves précliniques et cliniques et mécanismes moléculaires, Int. J. Mol. Sci. 19 (2018) 765.
[25] S. Ahmed, MM Hasan, H. Khan, ZA Mahmood, S. Patel, La vision mécaniste des polyphénols dans l'atténuation de la lithiase urinaire à l'oxalate de calcium, Biomed. Pharm. 106 (2018) 1292–1299.
[26] VV Prabhu, D. Sathyamurthy, A. Ramasamy, S. Das, M. Anuradha, S. Pachiappan, Évaluation des effets protecteurs de la diosmine (un flavonoïde d'agrumes) dans la lithiase urinaire induite par des produits chimiques chez des rats expérimentaux, Pharm. Biol. 54 (2016) 1513-1521.
[27] A. Noorafshan, S. Karbalay-Doust, F. Karimi,Diosmineréduit le dépôt d'oxalate de calcium et la dégénérescence tissulaire dans la néphrolithiase chez le rat : une étude stéréologique, le coréen J. Urol. 54 (2013) 252–257.
[28] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Chutipongtanate, Facteurs déterminant les types et morphologies des cristaux d'oxalate de calcium : concentrations molaires, tampon, pH, agitation et température, Clin. Chim. Acta 367 (2006) 120–131.
[29] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Sinchaikul, ST Chen, Analyse protéomique de la cytotoxicité induite par les cristaux d'oxalate de calcium monohydraté dans les cellules tubulaires rénales distales, J. Proteome Res. 7 (2008) 4689–4700.
[30] P. Amimanan, R. Tavichakorntrakool, K. Fong-ngern, P. Sribenjalux, A. Lulitanond, V. Prasongwatana, C. Wongkham, P. Boonsiri, WJ Umka, V. Thongboonkerd, Elongation factor Tu on Escherichia coli isolé de l'urine de patients souffrant de calculs rénaux favorise la croissance et l'agrégation des cristaux d'oxalate de calcium, Sci. Rep. 7 (2017) 2953.
[31] S. Khamchun, K. Sueksakit, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Effets modulateurs de la fibronectine sur la cristallisation, la croissance, l'agrégation, l'adhérence sur les cellules tubulaires rénales et l'invasion par la matrice extracellulaire, J. Biol. Inorg. Chim. 24 (2019) 235-246.
[32] S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Définition et analyses systématiques des indices d'agrégation pour évaluer le degré d'agrégation des cristaux d'oxalate de calcium, Front. Chim. 5 (2017) 113.
[33] R. Kanlaya, O. Naruepantawart, V. Thongboonkerd, Flagellum est responsable de la promotion des effets d'Escherichia coli viable sur la cristallisation de l'oxalate de calcium, la croissance des cristaux et l'agrégation des cristaux, Front. Microbiol 10 (2019) 2507.
[34] P. Peerapen, V. Thongboonkerd, Protéines liées différentielles et capacités adhésives des cristaux d'oxalate de calcium monohydraté de différentes tailles, Int. J. Biol. Macromol. 163 (2020) 2210-2223.
[35] K. Fong-ngern, K. Sueksakit, V. Thongboonkerd, La protéine de choc thermique de surface 90 sert de récepteur potentiel pour le cristal d'oxalate de calcium sur la membrane apicale des cellules épithéliales tubulaires rénales, J. Biol. Inorg. Chim. 21 (2016) 463–474.
[36] S. Chaiyarit, S. Mungdee, V. Thongboonkerd, Marquage non radioactif des cristaux d'oxalate de calcium pour les enquêtes sur l'interaction et l'internalisation des cellules cristallines, Anal. Méthodes 2 (2010) 1536–1541.
[37] S. Chaiyarit, N. Singhto, V. Thongboonkerd, Les cristaux d'oxalate de calcium monohydraté intériorisés dans les cellules tubulaires rénales sont dégradés et dissous par les endolysosomes, Chem. Biol. Interagir. 246 (2016) 30–35.
[38] W. Chiangjong, V. Thongboonkerd, Un nouvel essai pour évaluer les effets de promotion des protéines sur l'invasion des cristaux d'oxalate de calcium à travers la matrice extracellulaire basée sur l'activité plasminogène/plasmine, Talanta 101 (2012) 240–245.
[39] W. Chiangjong, V. Thongboonkerd, les cristaux d'oxalate de calcium ont augmenté la sécrétion d'énolase -1 des cellules tubulaires rénales qui ont ensuite amélioré l'invasion des cristaux et des monocytes par l'interstitium rénal, Sci. Rep. 6 (2016) 24064.
[40] R. Kanlaya, K. Sintiprungrat, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, La macropinocytose est le principal mécanisme d'endocytose des cristaux d'oxalate de calcium dans les cellules tubulaires rénales, Cell Biochem. Biophys. 67 (2013) 1171-1179.
[41] S. Sassanarakkit, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, StoneMod : une base deun reinprotéines modulatrices de pierre avec preuves expérimentales, Sci. Rép. 10 (2020) 15109.
[42] G. Eraslan, ZS Sarica, LC Bayram, MY Tekeli, M. Kanbur, M. Karabacak, Les effets de la diosmine sur les lésions hépatiques et rénales induites par l'aflatoxine, Environ. Sci. Pollution. Rés. Int. 24 (2017) 27931–27941.
[43] R. Russo, D. Chandradhara, N. De Tommasi, Comparative bioavailability of twodiosmineformulations après administration orale à des volontaires sains, Molecules 23 (2018) 2174.
[44] JQ Silveira, TB Cesar, JA Manthey, EA Baldwin, J. Bai, S. Raithore, Pharmacocinétique des glycosides de flavanone après ingestion de doses uniques de jus d'orange fraîchement pressé par rapport au jus d'orange transformé commercialement chez des humains sains, J. Agric . Chimie alimentaire. 62 (2014) 12576–12584.
[45] A. Frackowiak, P. Skibinski, W. Gawel, E. Zaczynska, A. Czarny, R. Gancarz, Synthèse de dérivés glycosides d'hydroxyanthraquinone capables de dissoudre et d'inhiber la formation de cristaux d'oxalate de calcium. Composés potentiels dans la thérapie des calculs rénaux, Eur. J. Med. Chim. 45 (2010) 1001–1007.
[46] F. Grases, J. Perello, B. Isern, RM Prieto, Etude d'une crème à base d'hexaphosphate de myo-inositol pour prévenir la calcinose cutanée dystrophique, Br. J. Dermatol. 152 (2005) 1022-1025.
[47] V. Thongboonkerd, Protéomique des interactions cristal-cellule : un modèle pour la recherche sur les calculs rénaux, Cellules 8 (2019) 1076.
[48] CF Verkoelen, Rétention de cristaux dans la lithiase rénale : un rôle crucial pour le glycosaminoglycane hyaluronane ? Confiture. Soc. Néphrol. 17 (2006) 1673–1687.
[49] K. Fong-ngern, A. Vinaiphat, V. Thongboonkerd, Lésion microvillaire dans les cellules épithéliales tubulaires rénales induite par le cristal d'oxalate de calcium et le rôle protecteur de l'épigallocatéchine-3-gallate, FASEB J. 31 (2017) 120 –131.
[50] J. Zhou, J. Jin, X. Li, Z. Zhao, L. Zhang, Q. Wang, J. Li, Q. Zhang, S. Xiang, Total flavonoids of Desmodium styracifolium attenuates the formation of hydroxy- Urolithiase à l'oxalate de calcium induite par la L-proline chez le rat, Urolithiasis 46 (2018) 231–241.
[51] J. Manissorn, K. Fong-ngern, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, Évaluation systématique des effets du pH de l'urine sur la cristallisation de l'oxalate de calcium, l'adhésion des cellules cristallines et l'internalisation dans les cellules tubulaires rénales, Sci. Rep. 7 (2017) 1798.
[52] S. Cui, J. Qian, P. Bo, Effet inhibiteur sur la phagocytose de Candida albicans induit par un prétraitement à la quercétine via l'interférence du cytosquelette d'actine, J. Tradit. Menton. Méd. 33 (2013) 804–809.
[53] S. Cui, Q. Wu, J. Wang, M. Li, J. Qian, S. Li, la quercétine inhibe la migration des macrophages induite par le LPS en supprimant la voie iNOS/FAK/paxilline et en modulant le cytosquelette, Cell Adhes . Migr. 13 (2019) 1–12.
[54] Y. Li, WG Gonzalez, A. Andreev, W. Tang, S. Gandhi, A. Cunha, D. Prober, C. Lois, ME Bronner, le recyclage membranaire induit par la macropinocytose entraîne la migration de la crête neurale en délivrant F- actine au lamellipode, Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 117 (2020) 27400–27411.
[55] H. Inaba, K. Yoda, H. Adachi, Le RapGEF GflB de liaison à l'actine F est nécessaire pour une macropinocytose efficace dans Dictyostelium, J. Cell Sci. 130 (2017) 3158–3172.
[56] A. Khan, Prévalence, mécanismes physiopathologiques et facteurs affectant la lithiase urinaire, Int. Urol. Néphrol. 50 (2018) 799–806.
[57] AP Evan, EM Worcester, FL Coe, J. Williams Jr., JE Lingeman, Mécanismes de formation de calculs rénaux humains, Urolithiasis 43 (Suppl 1) (2015) 19–32.
[58] S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Dysfonctionnement mitochondrial etun reinmaladie de la pierre, avant. Physiol. 11 (2020), 566506.
[59] SR Khan, Aspects histologiques du modèle « à particules fixes » de la formation des calculs : études animales, Urolithiasis 45 (2017) 75–87.
[60] VY Bird, SR Khan, Comment les pierres se forment-elles ? L'unification des théories sur la formation de la pierre est-elle possible ? Cambre. Esp. Urol. 70 (2017) 12–27.
[61] JP Kavanagh, Méthodes pour l'étude de la cristallisation de l'oxalate de calcium et leur application à la recherche sur la lithiase urinaire, Scanning Microsc. 6 (1992) 685–704, discussion 704-5.
[62] JP Kavanagh, L. Jones, PN Rao, Cinétique de cristallisation de l'oxalate de calcium à différentes concentrations d'urine humaine et artificielle, avec un rapport calcium/oxalate constant, Urol. Rés. 27 (1999) 231–237.
[63] NK Saw, PN Rao, JP Kavanagh, A. nidus, cristallurie et agrégation : ingrédients clés pour l'élargissement de la pierre, Urol. Rés. 36 (2008) 11–15.
[64] A. Borissova, GE Goltz, JP Kavanagh, TA Wilkins, Ingénierie inverse du rein : modélisation de la cristallisation de l'oxalate de calcium monohydraté dans le néphron, Med. Biol. Ing. Calcul. 48 (2010) 649–659.
[65] LA Thurgood, ES Sorensen, RL Ryall, L'effet de l'ostéopontine intracristalline et liée à la surface sur la fixation des cristaux d'oxalate de calcium dihydraté aux cellules rénales canines Madin-Darby (MDCK) dans l'urine humaine ultrafiltrée, BJU Int. 109 (2012) 1100–1109.
