Comment le facteur de croissance transformant B1 (TGF 1) affecte la fibrose rénale

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L'inhibition de la signalisation du facteur de croissance transformant b1 dans les cellules interstitielles résidentes atténue l'expression du gène profibrotique et préserve la production d'érythropoïétine pendant la fibrose rénale expérimentale chez la souris

Michaela AA Fuchs, Katharina AE Broeker & et al.

Fibrose rénalese caractérise par le développement de myofibroblastes provenant de reins résidents et de cellules immigrantes. La formation de myofibroblastes et la production de matrice extracellulaire lors de lésions rénales sont déclenchées par diverses cytokines. Parmi ceux-ci,facteur de croissance transformant B1(TGF 1) est considéré comme un déclencheur central pourfibrose rénale. Nous avons trouvé une expression hautement régulée à la hausse de TGF 1(facteur de croissance transformant B1)et les ARNm du récepteur 2 du TGF (TGF -R2) dans les cellules interstitielles rénales dans le cadre expérimentalfibrose. Ici, nous avons étudié la contribution du TGF 1(facteur de croissance transformant B1) signalant dans les cellules interstitielles rénales résidentes à la fibrose organique en utilisant les modèles de néphropathie induite par l'adénine et d'occlusion urétérale unilatérale chez la souris. À cette fin, la signalisation de TGFB1 a été interrompue par une délétion inductible du gène TGF-R2 dans les cellules interstitielles exprimant le récepteur B du facteur de croissance dérivé des plaquettes, marqueur des fibroblastes. L'expression des gènes profibrotiques a été atténuée jusqu'à 50 % dans les reins dépourvus de TGF-R2 dans les cellules positives pour le récepteur B du facteur de croissance dérivé des plaquettes. De plus, la suppression de TGF-R2 a empêché le déclin de la production d'érythropoïétine dans les reins ligaturés à l'uretère. Notamment, l'expression associée à la fibrose de l'actine du muscle lisse x en tant que marqueur de myofibroblaste et les dépôts de collagènes extracellulaires n'ont pas été modifiés chez les souris avec suppression ciblée du TGF-R2. Ainsi, nos résultats suggèrent un effet stimulant du TGF 1(facteur de croissance transformant B1)signalisation dans les cellules interstitielles résidentes qui contribuent à l'expression du gène profibrotique et à la régulation à la baisse de la production d'érythropoïétine mais pas au développement des myofibroblastes pendantfibrose rénale.

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Le développement et la progression defibrose rénaleest une caractéristique de la maladie rénale chronique. Elle est généralement considérée comme le résultat d'une production et d'un dépôt accrus de protéines de la matrice extracellulaire (ECM) telles que les collagènes, la fibronectine ou les ténascines. En coursfibrose rénaleconduit à un déclin progressif de la fonction glomérulaire et tubulaire et restreint également les fonctions endocriniennes des reins entraînant une production insuffisante d'érythropoïétine (EPO) conduisant à l'anémie.-y

Parmi les cytokines et les facteurs de signalisation impliqués dans les maladies rénales etfibroseprogression,facteur de croissance transformant 1(TGF 1) a été étudié dans divers modèles.6.0-1 TGF 1(facteur de croissance transformant B1)se lie au récepteur TGF 2 (TGF -R2). La formation d'un complexe hétéromère avec le récepteur 1 du TGF est essentielle pour l'activation intracellulaire de la cascade de signalisation SMAD. i.1-18 Dans les reins endommagés, expression accrue du TGF 1(facteur de croissance transformant B1)L'ARNm de différents types de cellules rénales a été signalé.1517,19-2lRôle important du TGF 1 dansun reinfibrosea également été délimitée à partir des découvertes selon lesquelles l'administration de TGF 1 exogène(facteur de croissance transformant B1)peut induirefibrose rénaleet que TGF 1(facteur de croissance transformant B1)les anticorps peuvent atténuer les effets induits expérimentalementfibrose,10.22-24En outre, la suppression génétique de Smad2 ou 3, les effecteurs intracellulaires du TGF -R2, a montré des effets positifs sur le développement defibrose.1,1

L'expression de TGF -R2 a été rapportée dans de nombreux types de cellules, limitant ainsi la valeur informative précise des résultats obtenus avec une interférence générale du TGF 1 global(facteur de croissance transformant B1)signalisation. Cela peut également expliquer certains des rapports controversés de ces dernières années.1.1.2 TGF 1(facteur de croissance transformant B1)a également été signalé comme favorisantun rein fibroseen améliorant l'infiltration des macrophages, qui peuvent se transdifférencier en myofibroblastes.

Cependant, le rôle central du TGF 1(facteur de croissance transformant B1)dansun reinfibrosea récemment été contestée par la conclusion queun reinfibrosen'est pas réduit en bloquant le TGF 1(facteur de croissance transformant B1)signalisation dans les cellules produisant activement des protéines matricielles. Il est bien établi que la production accrue de protéines matricielles provient principalement des myofibroblastes, qui peuvent se transdifférencier à partir de plusieurs types de cellules, notamment les fibroblastes, les monocytes, les péricytes et les cellules tubulaires et endothéliales.6,10,2-32 La contribution relative des ces types de cellules à la population de myofibroblastes peuvent varier selon le modèle expérimental. Néanmoins, le consensus croissant est que les fibroblastes résidents, les péricytes et les cellules dérivées de la moelle osseuse sont les principaux précurseurs des myofibroblastes dans le rein et contribuent àun reinfibrosedans une proportion similaire..102933-35 Les fibroblastes et les péricytes résidents expriment le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFR-) et sont l'un des plus nombreux,31,36. Une étude récente a également de nombreux types de cellules dans le rein. ont confirmé que les cellules PDGFR-f étaient les principaux précurseurs des myofibroblastes dans les reins humains. Ces cellules PDGFR-f comprennent également toutes les cellules rénales capables de produire des EpO,-9

Un rein fibroseest associée à une capacité réduite des reins à produire de l'EPO.-,3,0 Bien que les raisons n'aient pas été clairement résolues, on pense que la transformation des cellules interstitielles PDGFR- plus en myofibroblastes va main dans la main avec la perte de leur capacité à produire de l'EPO. Compte tenu du rôle majeur des cellules PDGFR-B interstitielles en tant que productrices natives d'EPO et en tant que précurseurs des myofibroblastes, nous nous sommes intéressés à définir le rôle du TGF 1(facteur de croissance transformant B1)signalisation dans cette population cellulaire.

Dans ce but, nous avons généré un modèle de souris avec suppression inductible par le tamoxifène du TGF -R2 dans les cellules PDGFR-plus (PDGFR- CeERT7 plus TGF -R2/, ci-après dénommées souris TGF -R2ko). Après suppression du TGF(facteur de croissance transformant)-R2 dans des cellules PDGFR- plus chez des souris adultes, les animaux ont été étudiés dans 2 modèles deun reinfibrose: occlusion urétérale unilatérale (UUO) et néphropathie induite par l'adénine (AN). La néphropathie induite par l'adénine est un modèle de dommages chroniques présentant de forts parallèles avec les pathologies humaines induites par les cristaux, tandis que l'UUO est un modèle de dommages aigus pour le stress mécanique.2933,42- ARNm cibles et marqueurs jusqu'à une résolution unicellulaire. Dans ces modèles pathologiques, les effets de la délétion de TGFB-R2 dans les cellules PDGFR-f sur l'expression de l'actine du muscle lisse d (a-SMA) en tant que marqueur de la formation de myofibroblastes ont été examinés. En outre, nous avons étudié l'expression du gène profibrotique et le dépôt d'ECM. La capacité des reins à produire de l'EPO dans des états expérimentauxun rein fibrosea été évaluée par des mesures des taux plasmatiques d'EPO et du nombre et de la localisation des cellules exprimant l'ARNm de l'EPO dans les reins endommagés.

MÉTHODES

Animaux

Des souris TGF -R2lo ont été générées en croisant des souris PDGFR- cexr2 (expression de la recombinase Cre inductible par le tamoxifène sous le contrôle du promoteur PDGFR ; JAX stock #029684) et mic avec TGF affranchi loxP6- Allèles R2 (stock IAX #012603) dans un fond mixte C57BJ/6 et 129S1/SvmJ. "Pour le traçage de la lignée, un double rapporteur fluorescent a interprété mT/mG(B6129(G)-Gt(ROSA)26Sorm4AcCTB-dromute.IGFLm/ ; JAX stock # 007676) a été élevé dans des souris TGF -R2ko. Le génotypage a été effectué à l'aide des amorces répertoriées dans le tableau 1. Les animaux de la même portée négatifs pour Cre ont été utilisés comme animaux témoins. accès à l'eau du robinet.Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire publié par les National Institutes of Health des États-Unis et approuvé par le comité d'éthique local.

Traitement au tamoxifène

La recombinaison Cre a été induite en nourrissant un régime alimentaire contenant 400 mg de citrate de tamoxifène par kilogramme (A115T00404, Sniff) pendant 4 semaines, suivies d'une période de 3- semaines avec de la nourriture standard. L'excision du gène TGF-R2 floxé a été confirmée par réaction en chaîne par polymérase,

Néphropathie induite par l'adénine

Induit par l'adéninefibrosea été généré chez des souris adultes. Après le traitement au tamoxifène et la période de repos suivante, les souris mâles ont reçu un régime alimentaire contenant de l'adénine (0 0,2 %) en continu pendant 3 semaines. Les expériences ont été réalisées après exactement 3 semaines (3-semaine d'adénine).

Hybridation in situ via RNAscope

La localisation de l'expression de l'ARNm a été étudiée avec le kit RNAscope Multiplex Fluorescent v2 (Advanced Cell Diagnostics ACD) selon les instructions du fabricant. Les reins ont été fixés par perfusion avec une solution de formaline tamponnée neutre à 10 %, déshydratés dans une série d'éthanol et inclus dans de la paraffine. Des signaux d'hybridation ont été détectés sur des séditions de tissus 5- μm à l'aide des fluorophores TSA Plus Cy3 et Cy5 (PerkinElmer). Les tranches ont été montées avec ProLong Gold Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) et visualisées avec un microscope Axio Observer Z1 (Zeiss). Les contrôles positifs et négatifs étaient systématiquement inclus. Les sondes RNAsape sont répertoriées dans le tableau 2

Tableau 1|Séquences d'amorce utilisées pour le génotypage des souris

RÉSULTATS

TGF 1(facteur de croissance transformant B1)et TGF(facteur de croissance transformant)-L'expression de R2 dans les cellules interstitielles est améliorée au cours d'une maladie rénale expérimentale

Localisation de l'expression des ARNm de TGFB1 et TGFB-R2 dans le rein dans des conditions basales et au cours d'expériencesfibrosea été réalisée par hybridation in situ RNAscope. Dans des conditions basales, l'expression de l'ARNm de TGFB-R2 a été détectée dans les cellules PDGFR-B tubulo-interstitielles dans toutes les zones rénales et dans les cellules mésangiales glomérulaires (Figure 1, à gauche). TGF -R2 a également été détecté dans les tubules proximaux ; l'expression dans d'autres segments tubulaires était plus faible (Figures supplémentaires S1 et S2).

Tableau 2|Sondes RNAscope utilisées pour l'hybridation in situ

TGFb1(facteur de croissance transformant B1)L'ARNm a été localisé dans les cellules PDGFR-bþ interstitielles dans toutes les zones rénales et dans les cellules mésangiales glomérulaires (Figure 1). Les tubules semblaient négatifs pour l'ARNm de TGFb1. Cela implique les cellules PDGFR-plus comme principal site d'expression du TGF 1(facteur de croissance transformant B1)dans le rein dans des conditions basales.

Tableau 3|Séquences d'amorce utilisées pour une réaction en chaîne par polymérase quantitative

Après 3 semaines de régime à base d'adénine (AN) ou 5-jour UUO, TGF 1 rénal(facteur de croissance transformant B1)et les niveaux d'expression d'ARNm de TGF-R2 ont été fortement augmentés chez les souris témoins (Figure 2).

Augmentation de l'expression du TGF 1(facteur de croissance transformant B1)et TGF -R2 après AN ou UUO a été localisé par RNAscope. Grâce à la colocalisation de marqueurs spécifiques au type de cellule, nous avons pu identifier les types de cellules rénales présentant une régulation positive du TGF -R2 lors de lésions rénales (Figure 3; Figures supplémentaires S2 et S3). Dans AN, l'expression de l'ARNm du TGF -R2 a été fortement augmentée dans le PDGFR- ainsi que des cellules dans les zones fibrotiques (figure 3a). Des tubules endommagés avec une expression élevée de TGF -R2 sont apparus avec un épithélium aplati et étaient entourés de cellules PDGFR-plus avec de forts TGF -R2 et TGF 1(facteur de croissance transformant B1)Signaux d'ARNm (Figure 3a et c, flèches; Figure supplémentaire S2). Les tubules avec des signaux TGF -R2 accrus ont montré de novo TGF 1(facteur de croissance transformant B1)Expression de l'ARNm (Figure 3c; Figure supplémentaire S3).

Dans les reins UUO, les signaux accrus pour l'ARNm du TGF-R2 ont été détectés dans les cellules interstitielles de la moelle externe restante (Figure 3b) et du cortex (Figure supplémentaire S2). Ces cellules PDGFR-plus ont également montré des signaux accrus pour le TGF 1(facteur de croissance transformant B1)(Figure 3d).

En résumé, ces résultats suggèrent une activation robuste du TGF 1(facteur de croissance transformant B1)signalisation entre les cellules PDGFR-plus interstitielles et les tubules endommagés lors de lésions rénales expérimentales.

Figure 1|Expression basale du récepteur 2 du facteur de croissance transformant b (à gauche) (TGFb-R2) et de l'ARNm du facteur de croissance transformant b1 (TGFb1) (à droite) sur des coupes rénales de souris de type sauvage.

La suppression inductible du TGF -R2 dans les cellules PDGFR-plus atténue l'expression du gène profibrotique au cours d'une maladie rénale expérimentale

Analyser la pertinence du TGF 1(facteur de croissance transformant B1)signalant la fonction des cellules PDGFR-plus, nous avons examiné des souris adultes TGF-R2ko. Expression basale du TGF 1(facteur de croissance transformant B1)était inchangé après délétion du TGF-R2 dans les cellules interstitielles du rein (figure 2). L'expression de l'ARNm de TGF-R2 était significativement réduite chez les animaux knock-out (Figure 2). L'expression résiduelle était due à l'expression tubulaire de TGF-R2 (Figure 1). La morphologie rénale n'était pas différente chez les souris TGF-R2ko jusqu'à 8 semaines après la suppression de TGF-R2.

L'augmentation observée de l'expression de TGF-R2 pendant AN et UUO a été significativement réduite dans les reins TGF-R2ko par rapport aux reins témoins (Figure 2). TGF 1(facteur de croissance transformant B1)l'expression n'était significativement réduite qu'après AN.

Une étude histologique du SMAD3 phosphorylé a montré une translocation réduite du facteur de transcription dans le noyau des cellules interstitielles a-SMAþ chez les animaux TGFb-R2ko, indiquant une signalisation TGFb1 perturbée après une suppression réussie du TGFb-R2 médiée par Cre (Figure 4).

Figure 2|Abondance de l'ARNm du facteur de croissance transformant b1 (TGFb1) et du récepteur 2 du TGFb (TGFb-R2) dans les reins témoins et les reins avec suppression inductible par le tamoxifène du TGFb-R2 dans les cellules positives du récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes b (TGFb-R2ko) sous basal et conditions pathologiques.

La suppression inductible de TGFb-R2 dans les cellules PDGFR-bD atténue l'expression du gène profibrotique au cours d'une maladie rénale expérimentale

Durantfibrose, la production de composants matriciels est améliorée, entraînant un dépôt important d'ECM et la formation de cicatrices. Évaluer le rôle possible du TGF 1(facteur de croissance transformant B1)signalisation dans les cellules PDGFR-Bf résidentes pour la production de matrice, nous avons comparé l'expression génique des marqueurs fibrotiques entre les souris témoins et TGF -R2ko.

L'alimentation en adénine et l'UUO ont entraîné des augmentations de -25- fois de l'ARNm de Collal dans les reins témoins. Alors que dans les reins TGF-R2ko, les augmentations d'ARNm de Collar ont été réduites de -50 % par rapport aux témoins (Figure 5). L'alimentation en adénine et l'UUO ont également entraîné des augmentations marquées des ARNm du collagène 3al et de la fibronectine. Les augmentations des deux ARNm ont également été significativement atténuées dans les reins TGF-R2ko.

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RÉFÉRENCES

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Remarque : ce qui précède n'est pas une liste de référence complète