In Silico-based Screen Synergistic Drug Combinations From Herb Medicines: Un cas utilisant Cistanche Tubulosa

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Neuroinflammationse caractérise par le répertoire élaboré de réponses inflammatoires des tissus du système nerveux central. Les limites des traitements actuels de la neuroinflammation sont des effets secondaires bien connus dans les essais cliniques de monothérapie. Les thérapies combinées de médicaments sont des stratégies prometteuses pour surmonter les mécanismes compensatoires et les effets of-target. Cependant, la découverte de combinaisons de médicaments synergiques à partir de plantes médicinales est rare. Encouragés par les cas appliqués avec succès, nous passons à l'étude des combinaisons de médicaments efficaces basées sur la pharmacologie systémique parmi les composés de Cistanche tubulosa (SCHENK) R. WIGHT. Tout d'abord, 63 composés bioactifs potentiels, les 133 cibles directes et indirectes associées sont éliminés par l'évaluation de la similarité des médicaments combinée au processus de ciblage des médicaments. Deuxièmement, le réseau Compound-Target est conçu pour acquérir l'ensemble de données permettant de prédire les combinaisons de médicaments. Nous listons les 10 meilleures combinaisons de médicaments qui sont employées par l'algorithme Probability Ensemble Approach (PEA), et le réseau Compound-Target-Pathway est ensuite construit par les 12 composés des combinaisons, des cibles et des voies pour découvrir les actions pharmacologiques correspondantes. Enfin, une approche de voie d'intégration est développée pour élucider les effets thérapeutiques de l'herbe dans différents processus biologiques pertinents pour les caractéristiques pathologiques. Dans l'ensemble, le procédé peut fournir une voie productive pour le développement de combinaisons thérapeutiques de médicaments.

Neurogèneneuroinflammationest défini comme des actions orchestrées de cellules immunitaires innées et adaptatives, de cellules vasculaires et de neurones déclenchées par des états pathologiques et une activité neuronale accrue dans le système nerveux central (SNC). Il est susceptible de jouer un rôle dans l'amorçage du SNCinflammatoireréactions par des conditions telles que la douleur, le stress psychologique et l'épilepsie ou devenir un facteur pathogène dans les maladies neurodégénératives. L'agent actuel pour le traitement de la neuroinflammation appartient principalement à la monothérapie, y compris la dopamine, la somatostatine, le neuropeptide, l'adénosine, etc. Cependant, par exemple, l'utilisation à long terme des médicaments courants mais anciens inhibiteurs de la COX, les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), peut entraîner des effets secondaires indésirables, des lésions gastro-intestinales ou des risques cardiovasculaires1,2 et les résultats des essais cliniques restent particulièrement insatisfaisants3, 4, il existe donc un besoin non satisfait de nouveaux traitements de la neuroinflammation.

La nouvelle thérapie combinatoire de médicaments peut être une stratégie croissante pour répondre aux besoins du développement de nouveaux médicaments ainsi que pour surmonter les obstacles dans les traitements de maladies complexes. Une combinaison de thérapie à plusieurs composants pourrait répondre aux exigences ci-dessus, dans laquelle deux médicaments ou plus sont utilisés ensemble5, avec les avantages énumérés : une efficacité plus élevée, une résistance croisée minimale, une faible dose avec moins d'effets secondaires et moins de toxicité par rapport à un médicament unique. agent6. Il est utilisé dans le traitement de maladies complexes7,8 depuis près de 30 ans. Curieusement, la thérapie combinée de médicaments est également appliquée dans la recherche sur les maladies neurologiques, par exemple, la combinaison de glimépiride et d'ibuprofène pourrait réduire efficacement l'inflammation dans la maladie d'Alzheimer (MA)9 ou la kétamine/atropine pourrait réduire l'expression des protéines pro-inflammatoires chez les souris épileptiques10. Les combinaisons de médicaments synergiques peuvent donc apporter une nouvelle inspiration pour tracer des traitements efficaces pourneuroinflammation. Par conséquent, comment pouvons-nous casser la noix dure pour obtenir les médicaments combinatoires optimaux ?

1Laboratoire clé de biologie des ressources et de biotechnologie en Chine occidentale, ministère de l'Éducation, École des sciences de la vie, Université du Nord-Ouest, Xi'an, Chine. 2Laboratoire de pharmacologie des systèmes, Centre de bioinformatique, Collège des sciences de la vie, Université Northwest A&F, Yangling, Chine. 3State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Jiangsu Kanion Parmaceutical Co. Ltd, Lianyungang, Chine. Jianling Liu et Jinglin Zhu ont contribué à parts égales à ce travail. La correspondance et les demandes de matériel doivent être adressées à CZ

Jianling Liu1, Jinglin Zhu1, Jun Xue1, Zonghui Qin1, Fengxia Shen1, Jingjing Liu1, Xuetong Chen2, Xiaogang Li1, Ziyin Wu2, Wei Xiao3, Chunli Zheng1 et Yonghua Wang1

De nos jours, les approches existantes pour éliminer les combinaisons de médicaments sont les suivantes, les enquêtes systématiques de paires de médicaments in vitro telles que la méthode de criblage à haut débit11 et le "Multiplex Screening for Interacting Compounds" (MuSIC)12 ou les évaluations des combinaisons de médicaments par paires avec de grands -expériences à grande échelle13,14. Néanmoins, la consommation excessive de main-d'œuvre, de ressources naturelles et la durée des tests empiriques ardus peuvent être un problème inévitable dans l'évaluation des combinaisons de médicaments efficaces. En réponse à la conquête des lacunes, des approches basées sur l'analyse de réseaux, en particulier les réseaux d'interactions génétiques15, les données de biologie des systèmes chimiques16 et les données moléculaires et pharmacologiques17 ont également émergé pour la découverte combinatoire de médicaments. En outre, un nombre croissant de chercheurs18,19 ont proposé de nouvelles approches de réseau pour prédire les combinaisons optimales et ont proposé la validation expérimentale correspondante dans l'intervalle, de sorte que l'intégration de la prédiction de réseau à la validation expérimentale peut être une nouvelle tendance dans le domaine de la prédiction combinatoire.

Les plantes médicinales impliquent un nombre considérable de formules (Fang-Ji en mandarin) et d'ingrédients chimiques, qui forment une base de données de produits naturels, de sorte qu'elle pourrait fournir des indices innovants, des données biologiques fondamentales pour le développement de combinaisons de médicaments, comme le professeur Li20,21 et le professeur Liu22 a introduit des méthodes d'analyse holistiques basées sur la biologie intégrée pour décrypter les mécanismes moléculaires des médicaments à base de plantes : pilule Liu-Wei-Di-Huang ou injection réductrice. Dans nos travaux précédents, nous avons trouvé non seulement deux herbes représentatives Lonicera japonica et Fructus Forsythia montrent des effets synergiques sur la grippe ou l'infammation23 mais aussi des composés rutine et amentoflavone présentent des effets synergiques dans la prévention de la dépression24.

Dans notre travail actuel, nous développons une approche de pharmacologie systémique pour découvrir les combinaisons de médicaments synergiques parmi les composés de l'herbeCistanche tubulosa(SCHENK) R. WIGHT, les étapes suivantes sont proposées : premièrement, nous sélectionnons des composés bioactifs par prédiction de la similarité des médicaments, qui sont utilisés comme appâts pour pêcher les cibles associées. Et puis, inspirés par le paradigme basé sur la "cible de réseau" pour prioriser les combinaisons d'agents synergiques à haut débit25, nous acquérons des combinaisons de médicaments efficaces parmi les composés potentiels sur la base d'un algorithme interne appelé Probability Ensemble Approach (PEA)26 avec efficacité de formation élevée, applicabilité étendue et deux indices quantitatifs pour décrire la propriété d'une combinaison de médicaments. Enfin, nous utilisons les cibles obtenues et les composés des paires candidates pour construire un réseau/voie puis fournir une analyse pour coder le mécanisme deCistanche tubulosasurneuroinflammationde manière holistique. À titre d'exemple, c'est la première fois qu'il est possible de sélectionner des combinaisons de médicaments efficaces à partir de produits naturels basés sur la pharmacologie systémique en intégrant des méthodes de calcul et une validation expérimentale pour approuver la fiabilité de la prédiction. Nous pensons que cela peut aider à personnalisertraitement de la neuroinflammation, améliorer notre compréhension du développement neuroprotecteur efficace et contribuera à la recherche préclinique future.

Résultats

Cibles de Cistanche tubulosa.

Pour obtenir les cibles liées àneuroinflammationnous obtenons d'abord les ingrédients dansCistanche tubulosa(SCHENK)R. WIGHT en recherchant dans la base de données TCMSP (http://lsp.nwu.edu.cn/), ce qui donne 103 composés (tableau supplémentaire S1, voir Matériels et méthodes). Ensuite, nous analysons leur ressemblance aux médicaments en appliquant le modèle de prédiction DL construit dans nos travaux précédents (voir Matériels et méthodes). De cette façon, nous obtenons 63 composés bioactifs potentiels (tableau supplémentaire S2) avec un indice DL supérieur ou égal à 0,18. Par la suite, grâce aux algorithmes Sys DT et WES, nous identifions 117 cibles de ces composés bioactifs potentiels. Enfin, 43 cibles potentielles (tableau supplémentaire S3) étroitement liées à la neuroinflammation sont récupérées après suppression du bruit et des erreurs, en cartographiant les 117 cibles des composés dans la base de données CTD.

Analyse d'enrichissement GOBP pour les cibles.

Pour vérifier si les protéines ciblées par les composés bioactifs potentiels sont étroitement liées àneuroinflammation, nous effectuons une analyse d'enrichissement GOBP en cartographiant les cibles sur DAVID. La figure 1 montre un arbre GO représentant les résultats de termes GOBP significativement enrichis (valeur P inférieure ou égale à 0.05), où les cibles sont classées en 20 groupes différents, tels que la régulation positive du muscle lisse vasculaire prolifération cellulaire et régulation positive de la migration leucocytaire. Parmi ces groupes, la transmission synaptique chimique,inflammatoirela réponse, la signalisation cellule-cellule, etc. sont toutes étroitement associées àneuroinflammation. Par exemple, les altérations synaptiques survenant au cours des maladies neuro-inflammatoires sont largement médiées parinflammatoirecytokines libérées par les cellules T infiltrantes et par la microglie activée et sont responsables, au moins en partie, d'une pathologie dendritique irréversible (collectivement, ces observations suggèrent que les cibles prédites peuvent probablement contribuer au traitement deneuroinflammation.

Construction et analyse du réseau composé-cible.

Généralement, les thérapies combinées réalisables et efficaces sont des combinaisons de composés bioactifs avec des propriétés pharmacocinétiques idéales, qui peuvent équilibrer le réseau de la maladie en régulant des cibles spécifiques. Par conséquent, nous construisons en outre un réseau composé-cible statique pour vérifier leurs relations topologiques. Comme le montre la figure 2, le réseau bipartite composé-cible (CT) présente 482 interactions entre 63 composés et 43 cibles d'une manière visuellement attrayante. Nous analysons le degré des nœuds dans le réseau composé-cible, ce qui donne un degré moyen par composé de 11,209 et 7,651 par cible, respectivement. Nous observons que parmi les 63 composés, 38 d'entre eux ajustent plus de 7 cibles (plus grand que le degré moyen), manifestant les effets synergiques potentiels entre eux.

Par exemple, la syringine (mol30) interagit avec le plus grand nombre de cibles, qui peuvent jouer un rôle de hub dans le réseau. Fait intéressant, une étude prouve que la syringine, un constituant phénolique, isolée d'Euonymus alatus (Thunb.) Sieb. (Celastraceae) a un effet anti-neuro-inflammatoire en inhibant la production de NO2.2'-acétylactéoside (mol42) contrôle 10 cibles différentes (degré=10). Parmi ces cibles, HSPB1 (également connu sous le nom de HSP27), comme un exemple est un chaperon moléculaire qui affiche des propriétés neuroprotectrices dans de nombreux modèles de maladies et de blessures. Pour le verbascoside (mol33), les propriétés neuroprotectrices de ce composé bioactif impliquent la modulation des facteurs de transcription et par conséquent une altération de l'expression des gènes, entraînant une régulation à la baisse de l'infammation30. Il convient de noter que bien que la propriété topologique du réseau ne biaise pas vers l'échinacoside (mol41, degré =7), il s'agit d'un nouveau composé potentiel actif par voie orale pour réguler la neuroinflammation et les signaux associés dans la maladie de Parkinson et peut fournir un nouveau perspectives de traitement clinique. Pris ensemble, ces résultats indiquent que les composés actifs potentiels criblés sont tous liés à la neuroinflammation et peuvent être considérés comme l'ensemble de données pour prédire les combinaisons de médicaments.

Construction et analyse du réseau composé-cible-voie.

En utilisant l'algorithme PEA, nous obtenons 10 combinaisons de médicaments différentes (tableau 1.), qui impliquent 12 composés. Ces combinaisons de médicaments sont toutes à forte probabilité de synergie, ce qui représente la possibilité d'induire une synergie entre deux composés. Par conséquent, jusqu'à un certain point, ces composés sont considérés comme les substances pharmacologiques fondamentales de Cistanche tubulosa. Sur la base des informations cibles de ces composés et des voies dérivées de DAVID, nous construisons le réseau composé-cible-voie (CTP) pour éclairer de manière préliminaire les mécanismes moléculaires de ces composés. Le réseau composé-cible-voie résultant se compose de 47 nœuds et 99 bords. Comme illustré sur la figure 3, ces composés peuvent agir non seulement sur les protéines en amont mais aussi en aval des voies associées à la neuroinflammation, en particulier les indicateurs directs des marqueurs de l'inflammation.

En particulier, la grande majorité des composés ciblent les protéines en amont telles que HSPB1, HTR2A, NTSRl et autres, indiquant la macro régulation de ces composés pour le traitement de la neuroinflammation. Par exemple, le composé échinacoside (mol41) cible la voie du VEGF via la protéine HSPB1 (Figure 1 supplémentaire). Heureusement, des études montrent que HSPB1 a des propriétés cytoprotectrices significatives dans plusieurs modèles de maladies neurologiques in vivo ou in vitro et qu'il peut jouer un rôle dans l'effet anti-inflammatoire en régulant la voie de signalisation du facteur nucléaire-KB (NF-KB)435. De plus, une étude démontre également que R-Ras pourrait réguler les activités angiogéniques des cellules endothéliales en partie via l'inhibition de l'axe p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK)-HSPB1 de la voie de signalisation du VEGF*.

Nous pouvons obtenir que le composé tubuloside A (mol56) cible la voie de signalisation du calcium via la protéine NTSRl dans le réseau. Tout le monde sait que les ions calcium (Ca² plus) sont un second messager universel dans les cellules du système immunitaire. La réduction de l'activité synaptique ou l'augmentation de la signalisation des récepteurs extrasynaptiques de l'acide N-méthyl-D-aspartique (NMDA) peut entraîner une dyshoméostasie nucléaire du calcium37,38, augmentant ainsi la survenue de neurodégénérescence et de dysfonctionnement cognitif. De plus, la protéine cible NTSRl est un membre de la grande superfamille des récepteurs couplés aux protéines G, et la signalisation est générée par la liaison des protéines G qui peuvent activer un système de second messager phosphatidylinositol-calcium et les kinases MAP en aval9.

Un autre exemple est que le composé 2'-acétylactéoside (mol42) cible la voie de signalisation GnRH via la protéine PRKCD. PRKCD, l'une des isoformes de la PKC, est un médiateur majeur de l'activation des protéines kinases extracellulaires régulées1/2 MAPK(ERK1/2 MAPK),c-Jun N-terminal protein kinases MAPK(JNK MAPK) et p38 MAPK par la gonadotrophine- libérant l'hormone (GnRH)0. Et, en tant que processus clés du réseau de signalisation stimulé par la GnRH, les cascades MAPK en aval et les métabolites de l'acide arachidonique (AA) pourraient produireinflammatoireprotéine, COX-2. Quant au kankanoside O (mol18) et à la syringine (mol30), ils interagissent directement avec les protéines en aval PTGS2, NOS2, et d'autresinflammatoireindicateurs, qui est un reflet intuitif de l'efficacité des composés. Une étude montre que la syringine pourrait supprimer la production de facteur de nécrose tumorale-c (TNF-c) dans les cellules RAW264.7 stimulées par les lipopolysaccharides (LPS)42. Et les autres études démontrent que la svringine pourrait également abaisser la concentration de NO et l'activité NOS ou la production de prostaglandine E2. Isoacteoside (mol43) MMP9 ciblé, est un acteur important du système nerveux central et serait une enzyme médiatrice putative pour les troubles neuropsychiatriques tels que la schizophrénie et la maladie bipolaire5, La dégradation de NF-KB et la phosphorylation de p38, ERK1/2, JNK MAPK ou Akt (protéine kinase B) des voies de signalisation en amont pourrait moduler l'expression du gène MMP9 et l'inhibition de MMP9 qui peut réduire l'expression des cellules inactivées par l'oxyde nitrique synthase inductible (iNOS) 46-48

Analyse des parcours.

Une "voie de neuroinflammation" incorporée est construite en intégrant les voies clés obtenues par l'analyse du réseau composé-cible-voie, y compris la voie de la maladie d'Alzheimer, la voie de signalisation du calcium, la voie de signalisation de la GnRH, la voie de signalisation du VEGF et la synapse sérotoninergique. Sur les 43 cibles, 19 peuvent être cartographiées sur la "voie de la neuroinflammation". Comme le montre la figure 4, la Cistanche tubulosa représente les cibles des composés actifs qui se distribuent dans la "voie de la neuroinflammation". La "voie de la neuroinflammation" est classée en 13 modules thérapeutiques différents, tels que la mort cellulaire, l'apoptose, l'inflammation et la neuroprotection. Dans cette étude, nous prenons des modules de mort cellulaire, d'inflammation et de neuroprotection comme exemples pour clarifier le mécanisme de Cistanche tubulosa pour la neuroinflammation.

Module de mort cellulaire. Les cibles situées dans la voie de la maladie d'Alzheimer sont principalement impliquées dans le processus de mort cellulaire, suggérant que la mort cellulaire est étroitement liée à la neuroinflammation. Des études démontrent que la neuroinflammation médiée par la microglie contribue à la mort des cellules neuronales, qui n'est pas limitée à une maladie spécifique mais impliquée dans diverses maladies telles que l'ischémie4, la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer5l. Comme le montre la Fig.4,

les cibles APP, GRIN2B et MAPT sont régulées par les composés actifs de Cistanche tubulosa indiquant qu'ils peuvent inhiber la mort cellulaire et ainsi offrir un traitement pour la neuroinflammation. Fait intéressant, le domaine intracellulaire APP altère la neurogenèse adulte chez les souris transgéniques en induisant une neuroinfammation52. L'incapacité de MAPT régule correctement la dynamique des microtubules neuronaux et médie ainsi la mort des cellules neuronales53. Tous ces éléments indiquent que Cistanche tubulosa peut traiter la neuroinflammation en inhibant la mort cellulaire.

Module inflammatoire.

Le terme neuroinflammation désigne les réactions inflammatoires dans le SNC en réponse à l'activité neuronale1. Dans cette étude, nous détectons l'implication de la voie de signalisation GnRH et de la voie de signalisation VEGF dans le module inflammatoire (Fig. 4). Par exemple, MMP2 dans la voie de signalisation de la GnRH appartient à la famille des MMP, qui sont exprimées dans des situations physiologiques et des conditions pathologiques impliquant une inflammation. Et les MMP régulent plusieurs fonctions liées à l'inflammation, notamment la biodisponibilité et l'activité des cytokines et des chimiokines inflammatoires54. De plus, la voie de signalisation du VEGF peut conduire à la génération de NOS2, de plus, elle participe à la réponse inflammatoire aiguë au LPS par de multiples mécanismes : implication dans la signalisation des cytokines pro-inflammatoires et altération de l'expression de différents gènes qui affectent les réponses inflammatoires-immunitaires au LPS. LPS55. Collectivement, tous ces éléments indiquent que Cistanche tubulosa peut guérir la neuroinflammation en régulant le système inflammatoire.

Module de neuroprotection.

La neuroprotection est l'ensemble des mécanismes et des stratégies utilisés pour se protéger contre les lésions neuronales ou la dégénérescence du SNC à la suite de troubles aigus (par exemple, accident vasculaire cérébral ou lésion/traumatisme du système nerveux) ou à la suite de maladies neurodégénératives chroniques (par exemple, Parkinson, Alzheimer, sclérose en plaques). L'objectif de la neuroprotection est de limiter le dysfonctionnement/la mort neuronale après une lésion du SNC et de tenter de maintenir la plus grande intégrité possible des interactions cellulaires dans le cerveau, ce qui se traduit par une fonction neuronale non perturbée. Comme on peut le voir sur la figure 4, certaines cibles de la voie de la synapse sérotoninergique sont impliquées dans la fonction de neuroprotection. Par exemple, la production de prostaglandines via PTGS1 et PTGS2 (également connu sous le nom de COX-1 et COX-2) est un médiateur essentiel dans l'évocation de mécanismes anti-inflammatoires et de nouveaux mécanismes pro-résolution56. Une étude récente a montré que l'expression génique de l'ADCY5, une enzyme qui catalyse la génération d'AMPc57, est réduite par la méthylation du promoteur dans les lignées cellulaires HCC humaines induites par la COX-2-58. Sur la base de l'analyse ci-dessus, nous supposons que l'accumulation de COX-2 peut influencer la sécrétion de sAPP, le clivage de l'APP clivée par la -sécrétase qui est modulée par l'AMPc et exercer en outre l'effet neuroprotecteur59,60. Nos résultats montrent que la neuroprotection joue un rôle important dans le traitement de la neuroinflammation.

Validation expérimentale

La viabilité des cellules microgliales BV2 traitées par les composés.

Les cellules microgliales BV2 (8 × 1 0 4 cellules / ml) sont alimentées avec des concentrations de 37, 5 à 300 uM par millilitre de milieu de culture sans sérum des quatre composés pendant 24 h. Nous considérons la viabilité cellulaire du groupe témoin cultivé en l'absence de sérum avec moins de 0,1 % de DMSO comme étant de 100 % (Fig.5(ad)). Apparemment, aucune cytotoxicité cellulaire significative n'est observée aux doses prescrites des groupes.

Validation de la synergie médicamenteuse et de l'effet anti-inflammatoire potentiel in vitro.

Pour évaluer plus avant les résultats obtenus in silico, quatre composés couvrant trois paires synergiques, à savoir l'isoactéoside, le 2'-acétylactéoside, l'échinacoside et le verbascoside, sont sélectionnés pour examiner leurs effets synergiques médicamenteux et leur effet anti-inflammatoire potentiel à l'aide de cellules BV2 traitées avec LPS. En particulier, nous effectuons une analyse Western blot pour l'expression des protéines iNOS et COX-2 afin de nous conformer à la synergie et aux effets anti-inflammatoires des combinaisons de médicaments prédites.

Comme le montre la figure 5 (par exemple), les niveaux de protéines iNOS et COX -2 dans le panel de lignées cellulaires BV2 testées sont rapportés. Nous observons que le traitement par isoacteoside ou 2'-acétylacteoside, les expressions protéiques de iNOS et COX -2 dans les cellules BV2 sont toutes deux diminuées de manière significative à différents niveaux de dose. Cependant, le traitement par l'association d'isoactéoside et de 2'-acétylactéoside induit une augmentation significative des facteurs inflammatoires iNOS et COX-2(Fig.5(e)). La figure 5(1) illustre que le traitement par l'échinacoside ou le verbascoside, en tant qu'agent unique, provoque une diminution de l'expression de l'iNOS et de la COX-2. De plus, comme attendu, le traitement par l'échinacoside en association avec le verbascoside à la concentration de 150 μM a entraîné une diminution plus prononcée des niveaux d'expression des protéines (iNOS et COX-2), indiquant les effets anti-inflammatoires synergiques de ce combinaison de médicaments. De même, comme indiqué sur la figure 5 (g), la combinaison d'échinacoside et de 2'-acétylactéoside montre un effet synergique significatif sur l'inhibition de COX -2 à la concentration de 75 μM ou 300 μM. Cependant, pour iNOS, à la dose de 300 μM, l'association représente une suppression marquée de la protéine. En revanche, nous constatons qu'il n'y a pas d'effets d'inhibition évidents sur iNOS et COX -2 concernant la combinaison d'isoactéoside et de 2'-acétylactéoside ou d'échinacoside et de verbascoside à la concentration de 75 μM (Figure supplémentaire 2), outre le traitement avec d'autres paires montre un effet beaucoup plus faible par rapport aux agents uniques à la dose de 150 ou 300 μuM que l'on peut voir sur la Fig. 5 (par exemple).

En résumé, l'étude in vitro fournit des informations supplémentaires pour le dépistage des combinaisons de médicaments ayant de puissants effets anti-inflammatoires et démontre la fiabilité de la stratégie de dépistage in silico.

Discussion

La neuroinflammation est impliquée dans la majorité des maladies neurologiques, psychiatriques et neurodéveloppementales car elle n'est pas seulement une conséquence mais pourrait être un déclencheur de la pathologie6!. Cependant, les traitements actuels des neuro-inflammatoires sont majoritairement des monothérapies, limitées par des effets secondaires bien connus comme on le sait. Les inhibiteurs de la COX-2 peuvent entraîner des malformations cardiovasculaires répondant à un traitement à long terme, et un traitement ciblant le TNF peut provoquer une infection par immunosuppression62. Des approches thérapeutiques combinatoires peuvent s'imposer pour améliorer le traitement des maladies complexes avec les avantages suivants : la robustesse du réseau contré et la compensation des pontages. l'efficacité clinique accrue tout en maintenant une toxicité humaine minimale et la posologie réduite de chaque composé63. Cependant, l'exploration des combinaisons de médicaments synergiques parmi les composés dérivés de plantes médicinales basées sur la pharmacologie systémique est peu limitée par la raison principale possible de grandes quantités de composés.

In the work, we firstly gain 63 potential bioactive compounds from the herb Cistanche tubulosa, fulfilling the criteria (DL>0.18) pour une analyse plus approfondie à l'aide de la prédiction qui est indispensable pour sélectionner des molécules plus prometteuses aux propriétés souhaitables. Après avoir cartographié les 133 cibles des 63 composés bioactifs potentiels dans la base de données, nous obtenons 43 cibles liées à la neuroinflammation, puis l'analyse de regroupement GOBP des cibles prédites peut probablement contribuer au traitement de la neuroinflammation. Le résultat analytique du réseau CT affiche un degré moyen par composé de 11,209 et 7,651 par cible, respectivement, et 38 d'entre eux ajustent plus de 7 cibles (plus grand que le degré moyen). Par exemple, l'échinacoside (mol41)4- prédit avec 7 cibles, le verbascoside (mol33)3067 avec 9 cibles ou le tubuloside B(mol57)686 avec 8 cibles pourraient jouer un rôle clé dans la neuroprotection, conformément à la littérature croissante.

Nous atteignons des cibles thérapeutiques directes telles que APP, MAPT (également connu sous le nom de Tau), PPARG70, MMP9, MMP27172 et HTR2A (également connu sous le nom de 5- HT2A), GRIN2B (récepteur ionotropique du glutamate de type NMDA sous-unité 2B) et GRIA1 ( la sous-unité 1) du récepteur ionotrope du glutamate de type AMPA ou des cibles potentielles en aval telles que PTGS274 ou NOS27 qui sont associées à la neuroinflammation ou à diverses maladies du système nerveux,

L'analyse du réseau Compound-Target-Pathway affiche 12 composés parmi les 10 meilleures paires de médicaments via l'algorithme PEA, connectés aux 43 cibles potentielles et aux voies liées à la neuroinflammation, par exemple, la voie de signalisation du calcium, l'interaction ligand-récepteur neuroactif ou voie de signalisation TNF, etc. Dans le système, ces composés prédits pourraient agir non seulement sur les protéines en amont mais aussi en aval des voies associées à la neuroinflammation et aux biomarqueurs inflammatoires. en particulier, De plus, les informations supplémentaires pour le dépistage des combinaisons de médicaments ayant des effets potentiellement anti-inflammatoires sont fournies et la fiabilité de la stratégie de dépistage in silico est vérifiée par une validation expérimentale. La voie de la neuroinflammation comprend la voie de la maladie d'Alzheimer, la voie de signalisation du calcium, la voie de signalisation de la GnRH, la voie de signalisation du VEGF et la synapse sérotoninergique. Les résultats analytiques nous ont clairement expliqué que les modules de mort cellulaire, d'inflammation et de neuroprotection sont illustrés pour déchiffrer le mécanisme de Cistanche tubulosa pour le traitement de la neuroinflammation.

La neuroinflammation accompagne diverses maladies neurodégénératives qui pourraient être non seulement une conséquence mais un déclencheur de pathologie, ainsi, les thérapies anti-inflammatoires sont suggérées comme une approche thérapeutique prometteuse !. À notre grande déception, bien que nous ayons réalisé la limitation des monothérapies, l'évaluation et les mécanismes sous-jacents des thérapies combinées restent les défis majeurs dans le développement de la nouvelle stratégie alternative. Ces travaux pourraient donc offrir de nouvelles opportunités thérapeutiques pour la neuroinflammation et pourraient ouvrir une nouvelle voie pour découvrir des combinaisons de médicaments à partir de produits naturels.

Matériaux et méthodes

Collecte de composés.

Un total de 66 ingrédients chimiques de Cistanche tubulosa sont collectés manuellement à partir du TCMSP (http://lsp.nwuedu.cn/)6, dont 26 glycosides phényléthanoïdes, 22 iridoïdes, 4 lignanes, 7 glycosides mono-terpéniques, 2 substances azotées, 3 benzène sucres acryloyles, 1 stérol, 1 cétol. Étant donné que les glycosides de Cistanche tubulosa sont généralement hydrolysés pour libérer de l'aglycone qui est ensuite absorbé dans la muqueuse intestinale, nous prenons donc en considération les molécules sans glycolique, qui sont étiquetées comme qt. Cela a conduit à la génération des 103 composés. Ces molécules sont fournies dans le tableau supplémentaire S1.

Évaluation de la similarité des médicaments. Pour obtenir les composés bioactifs potentiels de Cistanche tubulosa, nous évaluons la similarité médicamenteuse de ces ingrédients en calculant la similarité Tanimoto77 entre les composés à base de plantes et les propriétés moléculaires moyennes de tous les produits chimiques dans la base de données Drugbank8. De plus, le modèle de prédiction DL a été appliqué avec succès dans de nombreuses études98 pour sélectionner des composés bioactifs. Dans le travail, l'indice DL supérieur ou égal à 0.18 des candidats est défini comme la valeur seuil pour mieux convenir à une analyse ultérieure.

Prédiction de la cible médicamenteuse.

L'identification des cibles d'efficacité pour les principaux composés reste une étape clé pour faire progresser les composés dans le développement de médicaments. Ici, deux outils internes : SysDT et WES sont utilisés pour dériver les informations sur la cible moléculaire pour la pêche à la drogue. Sys DT est un modèle in silio qui est réalisé avec la combinaison des informations chimiques, génomiques et pharmacologiques basées sur les deux puissants outils mathématiques : Random Forest (RF) et Support Vector Machine (SVM) pour aborder efficacement la question de l'identification des cibles2. Le modèle obtenu sert de plate-forme précieuse pour la prédiction des interactions médicament-cible avec une précision globale de 97,3 %, une précision de prédiction activée de 87,7 % et une précision de prédiction inhibée de 99,8 %. Afin de capturer des composants plus prometteurs, le les critères de filtrage sont définis comme une valeur RF supérieure ou égale à 0.7 ou SVM supérieure ou égale à 0.8 dans cette étude.

La similarité d'ensemble pondérée (WES) est un nouveau modèle de calcul puissant pour identifier les cibles directes des médicaments des ingrédients bioactifs réels. En tant que nouvel outil, le modèle obtenu fonctionne bien pour prédire la liaison avec une sensibilité moyenne de 85 % (SEN) et les modèles non contraignants avec 71 % (SPE) avec les aires moyennes sous les courbes de fonctionnement du récepteur (ROC, AUC) de 85,2 % et une concordance moyenne de 77,5 %. Les cibles obtenues sont ensuite cartographiées sur Uniprot (http://www,uniprot.org) pour normaliser ultérieurement leurs noms et organismes. Ici, nous choisissons uniquement les cibles d'Homo sapiens pour une analyse plus approfondie. Les cibles candidates des composés sélectionnés sont cartographiées dans la base de données CTD (http://ctdbase.org/) pour obtenir leurs maladies associées et nous sélectionnons enfin les cibles potentielles liées à la neuroinflammation.

Enrichissement GO et analyse des cibles. Pour sonder les processus biologiques impliqués des cibles obtenues, nous mappons les cibles sur DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov)8 et les termes avec une valeur P inférieure à 0.05 sont choisis dans cette section.

Analyse des combinaisons de médicaments.

Dans nos travaux précédents, un cadre de pharmacologie systémique a été exploité pour prédire les combinaisons de médicaments sur un modèle nouvellement conçu, appelé Probability Ensemble Approach (PEA) dans le but d'analyser l'efficacité clinique et les effets indésirables des combinaisons de médicaments. En détail, un réseau bayésien intégrant un algorithme de similarité a été développé pour modéliser les combinaisons d'effet moléculaire et pharmacologique du composé. L'évaluation combinée couvrant l'efficacité clinique et les effets indésirables pour les paires prédites a ensuite été présentée26. En bref, cela montre que PEA pourrait prédire l'efficacité des paires avec une spécificité et une sensibilité élevées (AUC=0.90) dans notre travail. Dans ce travail, nous sélectionnons les dix meilleures combinaisons de médicaments en fonction de leurs probabilités de synergie, qui représentent la possibilité d'induire une synergie entre deux composés.

Création et analyse de réseaux/voies.

Pour étudier les relations entre les ingrédients actifs et les maladies inflammatoires, le réseau composé-cible (CT) et le réseau composé-cible-voie (CTP) sont générés par Cytoscape 2.8.1, un progiciel bioinformatique populaire pour la visualisation du réseau biologique et l'intégration des données※. Les propriétés quantitatives du réseau sont analysées par les deux plugins suivants Network Analyzer et CentiScaPe 1.2. Dans le réseau graphique, les nœuds indiquent soit des composés, des cibles ou des voies tandis que les bords codent l'interaction médicament-cible. les informations à jour sur la pathologie de la neuroinflammation. Premièrement, en les cartographiant sur la base de données KEGG (http://www.genome.jp/kegg/), les profils cibles obtenus sont agrégés en plusieurs voies. Après avoir abandonné les tronçons indirects, une voie relativement synthétisée est alors intégrée manuellement compte tenu des données pathologiques et cliniques.

Validation expérimentale

Préparation des échantillons.

L'échinacoside, le verbascoside, l'isoactéoside et le 2'-acétylactéoside sont achetés auprès de Nanjing Zelang Biological Technology Co., Ltd. (Nanjing, Jiangsu, Chine). Les échantillons de test sont dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) (Sigma, États-Unis) pour obtenir 100 mM, en tant que solution mère, puis stockés à 4 °C. Les dilutions finales de DMSO ajoutées au milieu de culture n'ont jamais dépassé 0,1. pour cent qui assuré qu'il n'y a aucun effet sur la viabilité cellulaire.

Culture de cellules. Les cellules de la microglie de souris BV2 sont initialement développées par la banque de cellules de l'Académie chinoise des sciences de Shanghai et cultivées dans des flacons de 25 ou 75 cm2 avec le milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM/HEPES 25 mM) (Gibco BRL, États-Unis) complété par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) ( Gibco BRL, USA), pénicilline G (100 unités/mL) et streptomycine (100 mg/mL) dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO,/95 % d'O, à 37 degrés 0,5 % de CO2.

Analyse Western blot. La protéine cellulaire est extraite des lignées cellulaires à l'aide d'un kit de préparation de protéines QproteomeMammalian (Qiagen, Allemagne) après les procédures indiquées conformément au protocole du fabricant. Le kit Quick Stari Bradford Protein Assay (Bio-Rad, USA) est appliqué à la quantification des protéines. Des quantités équivalentes de protéines (50ug) sont dénaturées par ébullition à 100 degrés pendant 10 min avec un tampon de chargement d'échantillon de 2 * laemmli (Bio-Rad, États-Unis) plus 5 % de 3-mercaptoéthanol dans un rapport de 1: 1 et chargé par voie sur SDS-PAGE à 12% (mini gels de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide), électrotransféré sur des membranes de polyfluorure de vinylidène (PDVF) de 0,45 um (Millipore, Bedford, MA, États-Unis) pendant 150 min à 200 mA. Par la suite, les membranes sont bloquées dans 3 % d'albumine de sérum bovin (BSA) à température ambiante et incubées avec les anticorps primaires iNOS et COX -2 (Abcam) à 4 degrés pendant la nuit. Après trois lavages approfondis dans une solution saline tamponnée au Tris (TBST) pendant 5 min chacun, les membranes sont sondées avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) (dilutions 1: 10000; Abcam) pendant 1,5 h à température ambiante. Les bandes immunoréactives sont ensuite visualisées à l'aide d'un kit de détection de chimiluminescence ECL (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Californie, USA) après lavage deux fois dans du TBST et une fois dans du TBS, à chaque fois pendant 5 min. Les valeurs densitométriques sont normalisées en utilisant -actin comme contrôle interne de chargement.

Analyses statistiques. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± erreur standard, l'analyse Western blot est répétée trois expériences indépendantes avec le même résultat. L'analyse unidirectionnelle de la variance est utilisée pour comparer les différences de moyennes pour trois groupes ou plus, la signification statistique est analysée avec le test de Student entre deux groupes. Matériel et réglages. Excel de Microsoft Office2013 a été utilisé dans la Fig.1.

Cytoscape 2.8.1 a été utilisé dans la Fig.2. Cytoscape 2.8.1 a été utilisé dans la Fig.3.

Visio de Microsoft Office2013 a été utilisé dans la Fig. 4.

Graphpad Prism 6 et Visio de Microsoft Office 2013 ont été utilisés dans la Fig.5.

Disponibilité des données. Les ensembles de données générés pendant et/ou analysés pendant l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Remerciements la recherche est soutenue financièrement par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NO. U1603285, NO. 81373892 et NO. 31540008) et l'industrialisation du projet pilote dans le département de l'éducation de la province du Shaanxi : industrialisation d'additifs alimentaires de fermentation de micro-organismes sans pollution verte (N° 2010JC22).

Les contributions de l'auteur

Contributions des auteurs à la conception et à la conception : JLL, YHW et CLZ ont conçu et conçu l'étude. Prédiction des cibles médicamenteuses et enrichissement GO et analyse des cibles : XTC et ZHQ Analyse des combinaisons de médicaments et création et analyse de réseaux/voies : JLZ, ZHQ, FXS et JJL Expériences et acquisition de données JLZ, JX et ZHQ Analyse et interprétation des données JLZ , JX, ZYW et WX Rédaction du manuscrit : JLZ et CLZApprobation de la version finale du manuscrit soumis : J.LL, CL.Z.et YH.W.Révision par CLZ, JLZet XGL

Informations Complémentaires

Des informations supplémentaires accompagnent cet article sur https://doi.org/10.1038/s41598-017-16571-3. Intérêts concurrents : Les auteurs déclarent n'avoir aucun intérêt concurrent.

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