Évaluation in vitro de la photoréactivité et de la phototoxicité des antioxydants polyphénols naturels

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Résumé:Les polyphénols sont une grande famille de composés naturels largement utilisés dans les produits cosmétiques en raison de leurs propriétés bénéfiques antioxydantes et anti-inflammatoires et de leur capacité à prévenir le stress oxydatif induit par les rayons UV. Comme ces composés présentent des chromophores et sont appliqués directement sur la peau, ils peuvent réagir avec la lumière du soleil et exercer des effets phototoxiques. Les informations scientifiques disponibles sur le potentiel phototoxique de ces composés naturels étant rares, le but de cette étude était d'évaluer la photoréactivité et la phototoxicité de cinq composés phénoliques.antioxydantsavec une utilisation documentée dans les produits cosmétiques. Un test ROS standard a été validé et appliqué pour dépister la photoréactivité des antioxydants phénoliques naturels acide caféique, acide férulique, acide p-coumarique,3,4-acide dihydroxyphénylacétique (DOPAC) et rutine. Le potentiel de phototoxicité a été déterminé en utilisant une lignée cellulaire de kératinocytes humains (HaCaT), basée sur le test de phototoxicité 3T3 Neutral Red Uptake. Bien que toutantioxydants phénoliques étudiésrayonnement UV/Vis absorbé dans la plage de 290 à 700 nm, seul le DOPAC était capable de générer de l'oxygène singulet. La génération d'espèces réactives de l'oxygène est une réaction chimique à un stade précoce faisant partie du mécanisme de phototoxicité. Pourtant, aucun des composés étudiés n'a diminué la viabilité des kératinocytes après irradiation, conduisant à la conclusion qu'ils n'ont pas de potentiel phototoxique. Les données obtenues avec ce travail suggèrent que ces composés sont sûrs lorsqu'ils sont incorporés dans des produits cosmétiques.

Mots clés:sécurité des photos ; photoréactivité; phototoxicité; polyphénols;antioxydants phénoliques naturels; les espèces réactives de l'oxygène; les kératinocytes ; soin de la peau; produits cosmétiques

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Introduction 

Les polyphénols (PP) constituent l'un des groupes de produits naturels les plus nombreux et les plus répandus du règne végétal. La structure chimique des PP est caractérisée par la présence d'un ou plusieurs groupements hydroxyles phénoliques, liés à un ou plusieurs systèmes cycliques benzéniques [1]. Les polyphénols présentent une variété d'activités biologiques bénéfiques chez l'homme, notamment une action antivirale, antibactérienne, anticancérigène, hépatoprotectrice, anti-inflammatoire et antioxydante [2-5].En tant qu'antioxydants, les polyphénols peuvent protéger les constituants cellulaires contre les effets néfastes oxydatifs des espèces réactives de l'oxygène (ROS), telles que l'oxygène singulet, le superoxyde et les radicaux hydroxyles, limitant le risque de plusieurs maladies associées au stress oxydatif [6,7]. En raison de leurs propriétés chimiques, les PP sont capables de piéger les ROS et de chélater les ions de métaux de transition, tels que le fer et le cuivre, ce qui a suscité l'intérêt de l'industrie cosmétique pour leur utilisation dans les formulations de soins de la peau [8-10]. L'exposition aux ultraviolets (UV) est l'un des principaux facteurs induisant le cancer de la peau, et les cellules cutanées peuvent être endommagées directement par le rayonnement UV ou indirectement par la surproduction de ROS médiée par les UV [11]. Des études expérimentales et épidémiologiques ont suggéré que les polyphénols protègent la peau des effets néfastes des rayons UV par de multiples voies [12]. Ainsi, plusieurs composés appartenant à cette famille sont déjà utilisés comme ingrédients dans un certain nombre de produits cosmétiques commerciaux disponibles sur le marché [13]. La demande croissante des consommateurs pour les cosmétiques naturels a poussé l'industrie à développer des formulations utilisant des extraits naturels avec des ingrédients actifs, tels que les polyphénols, comme une solution prometteuse et efficace pour les soins de la peau [13]. Cependant, les chromophores présents dans la structure des polyphénols ont la capacité d'absorber le rayonnement UV/Vis et de subir des réactions chimiques entraînant une cascade d'événements pouvant entraîner des réactions phototoxiques [14]. La phototoxicité est définie comme une réponse toxique déclenchée par des produits chimiques photoréactifs administrés par voie topique ou systémique après l'exposition du corps à la lumière ambiante [15]. Les ingrédients pharmaceutiques actifs et les excipients pour l'administration systémique, les formulations cliniques pour l'application topique, les patchs dermiques et autres, ont un potentiel phototoxique et peuvent provoquer des réactions phototoxiques notables. Par conséquent, les agences de réglementation, US FDA, EU EMA et ICH, fournissent des directives de sécurité des photos, introduisant des méthodes de test et des stratégies d'évaluation [15-17]. L'évaluation de la sécurité des produits cosmétiques est obligatoire conformément à la législation de l'Union européenne [18]. L'évaluation de la sécurité requise comprend des études toxicologiques pertinentes sur les ingrédients cosmétiques, y compris une évaluation de la toxicité photo-induite [18]. Depuis l'interdiction des tests sur les animaux pour les produits cosmétiques, un certain nombre de tests de photosécurité in vitro ont été proposés au cours des dernières années, notamment l'analyse du spectre UV, un test de phototoxicité 3T3 Neutral Red Uptake (3T3 NRU PT) et une espèce réactive de l'oxygène ( ROS) [18–20]. Le test ROS a été conçu pour l'évaluation de la photoréactivité des médicaments, dont le principe est de surveiller les réactions photochimiques dans les produits chimiques testés exposés à la lumière solaire simulée [19,20]. Grâce à ces réactions photochimiques, des ROS, tels que l'anion superoxyde et l'oxygène singulet, peuvent être générés, et ces processus photochimiques peuvent être un déclencheur de la phototoxicité induite par les médicaments [19,20]. Des niveaux élevés de ROS peuvent provoquer une cytotoxicité en endommageant l'ADN, les lipides et les protéines par le stress oxydatif.https://www.voachinese.com/a/us-lawmakers-united-condemn-russias-ukraine-invasion-20220224/6458599.htmlLa méthodologie in vitro 3T3 NRU-PT utilise la lignée cellulaire de fibroblastes de souris Balb/c 3T3 et l'absorption de rouge neutre comme critère de cytotoxicité. La phototoxicité est ensuite déterminée par la réduction relative de la viabilité des cellules exposées au produit chimique d'essai en présence et en l'absence de lumière simulant la lumière du soleil. Des études rapportées dans la littérature ont conclu que ce test est trop sensible, prédisant à tort les risques de sécurité des photos animales et humaines, conduisant à un nombre élevé de faux positifs par rapport aux résultats in vivo [21-23]. Compte tenu de cette limitation, une modification de la méthodologie 3T3 NRU-PT a été proposée par notre groupe basée sur l'utilisation d'une lignée cellulaire de kératinocytes humains (HaCaT) [24]. Étant donné que cette méthodologie utilise des cellules de kératinocytes humains, elle représente un modèle plus réaliste, étant donné qu'il s'agit du type de cellules le plus abondant présent dans la couche externe de la peau, où les composés topiques sont appliqués et exposés au rayonnement solaire [24]. Le but de la présente étude était d'estimer le potentiel de toxicité photo-induite des polyphénols naturels acide p-coumarique, acide caféique, acide 3,4-dihydroxyphénylacétique (DOPAC), acide férulique et rutine (Figure 1), qui sont déjà utilisés comme ingrédients cosmétiques ou sont envisagés en raison de leurs propriétés chimiques et antioxydantes intéressantes [25-27]. Un test ROS a été validé et mis en œuvre pour l'évaluation photographique exploratoire des composés, et leur cytotoxicité et leur phototoxicité ont été évaluées plus en détail à l'aide d'une lignée cellulaire de kératinocytes humains (HaCaT).

2. Résultats et discussion 

La considération initiale pour l'évaluation du potentiel photoréactif est de savoir si un composé absorbe les photons à n'importe quelle longueur d'onde entre 290 et 700 nm. Un composé qui a un coefficient d'extinction molaire (MEC) supérieur à 1000 L mol−1 cm−1 à toute longueur d'onde entre 290 et 700 nm est considéré comme suffisamment photoréactif pour entraîner une phototoxicité directe [15]. Les spectres d'absorption des acides caféique, p-coumarique et férulique, du DOPAC et de la rutine dans le DMSO à la lumière UV-visible sont illustrés à la figure 2. Tous les composés absorbent dans la plage spectrale de 200 à 700 nm, avec une longueur d'onde maximale à ou au-dessus de 290 nm et avec une MEC typiquement supérieure à 4000 L mol-1 cm-1 (tableau 1). Les polyphénols sont des composés biologiques contenant des systèmes conjugués π avec des groupes hydroxyles phénoliques. Les transitions électroniques des orbitales moléculaires de type π sont responsables du spectre UV-visible de ce groupe de composés [28]

Tous les composés testés présentaient une MEC supérieure à 1000 L mol−1 cm−1, ce qui signifie que tous sont d'éventuels composés phototoxiques à étudier [15]. Avant d'effectuer le test ROS, le simulateur solaire a été évalué et les conditions expérimentales ont été optimisées pour s'assurer que les valeurs mesurées d'oxygène singulet (SO) et d'anion superoxyde (SA) étaient proches de celles mentionnées dans la littérature [29]. L'optimisation du test de génération de ROS a été réalisée à l'aide de contrôles positifs et négatifs et une étude de faisabilité a été menée à l'aide de produits chimiques de référence. Dans les conditions expérimentales utilisées, toutes les substances testées dans l'étude de faisabilité répondaient aux critères d'acceptation donnant des valeurs de SO et SA dans les plages de valeurs admissibles [29].

Le test ROS a été effectué pour les composés polyphénoliques, et la capacité des substances testées à générer des ROS, à la concentration de 200 µM, est indiquée dans le tableau 2. Tableau 2. Les résultats ont été obtenus pour les composés testés à l'aide du test ROS.

Les résultats obtenus montrent qu'à l'exception du DOPAC, tous les composés peuvent être classés comme non photoréactifs. Bien que ces substances aient montré une absorption de la lumière UV-visible et une MEC supérieures à 1000 L mol−1 cm−1, elles n'ont pas généré de ROS dans les conditions testées, qu'il s'agisse d'espèces SO ou SA. De manière surprenante, le DOPAC a été capable d'induire la génération d'espèces SO et a donc été classé comme photoréactif, bien que ce composé ait la valeur MEC la plus faible dans la gamme UV-visible parmi tous les composés étudiés. D'autres études sont nécessaires pour comprendre les résultats obtenus pour le DOPAC, qui pourraient également être importants, dans un avenir proche, pour établir une corrélation entre la structure chimique d'un composé et sa capacité à être photoréactif. La cytotoxicité du DMSO utilisé pour l'évaluation des effets phototoxiques, en présence et en l'absence d'irradiation, après 1h d'exposition a été évaluée. Pour la plaque non irradiée, le DMSO n'a pas montré de différence statistiquement significative par rapport aux témoins négatifs. Cependant, pour la plaque irradiée, il y avait une différence significative entre le DMSO à 1 % et le témoin de solvant par rapport aux témoins négatifs (p < 0,0001),="" ce="" qui="" justifiait="" l'utilisation="" du="" témoin="" de="" solvant="" sur="" toutes="" les="" expériences="" pour="" garantir="" que="" les="" différences="" de="" viabilité="" cellulaire="" n'ont="" été="" attribués="" qu'aux="" composés="" à="" l'étude.="" pour="" garantir="" la="" faisabilité="" du="" test="" de="" phototoxicité="" à="" l'aide="" d'une="" lignée="" cellulaire="" de="" kératinocytes="" humains="" (hacat),="" le="" 5-méthoxy="" psoralène,="" le="" chlorhydrate="" de="" chlorpromazine="" et="" la="" quinine="" ont="" été="" testés="" comme="" témoins="" positifs,="" et="" l'acide="" acétylsalicylique,="" l'hexachlorophène="" et="" le="" laurylsulfate="" de="" sodium="" comme="" témoins="" négatifs="" [24].="" les="" résultats="" obtenus="" à="" partir="" du="" test="" de="" phototoxicité="" comparant="" la="" viabilité="" cellulaire="" des="" cellules="" hacat,="" irradiées="" et="" non="" irradiées,="" en="" présence="" des="" composés="" (poly)phénoliques="" testés="" sont="" représentés="" sur="" la="" figure="" 3.="" les="" gammes="" de="" concentrations="" des="" produits="" chimiques="" testés="" en="" présence="" (irr="" plus="" )="" et="" l'absence="" (irr−)="" de="" lumière="" ont="" été="" déterminées="" dans="" des="" expériences="" de="" recherche="" de="" dose,="" en="" considérant="" la="" concentration="" maximale="" de="" 1000="" µm.="" une="" série="" de="" dilutions="" géométriques="" a="" été="" utilisée="" et="" ajustée,="" si="" nécessaire,="" en="" fonction="" de="" la="" concentration-réponse="" en="" présence="" et="" en="" l'absence="" d'irradiation.="" dans="" la="" plage="" de="" concentration="" testée="" (12,5="" ;="" 31,25="" ;="" 62,5="" ;="" 125="" ;="" 250="" ;="" 500="" et="" 1000="" µm),="" aucune="" des="" substances="" testées="" n'a="" induit="" une="" diminution="" de="" 50="" %="" de="" la="" viabilité="" cellulaire,="" par="" conséquent,="" il="" n'a="" pas="" été="" possible="" de="" calculer="" les="" valeurs="" ic50="" et="" pif="" correspondantes.="" .="" au="" contraire,="" il="" a="" été="" possible="" de="" percevoir="" une="" augmentation="" dose-dépendante="" de="" la="" viabilité="" des="" cellules="" irradiées="" en="" présence="" des="" substances="" testées,="" possiblement="" due="" aux="" effets="" photoprotecteurs="" de="" ces="" antioxydants="" contre="" les="" dommages="" oxydatifs="" induits="" par="" le="" rayonnement="" conduisant="" à="" un="" pourcentage="" plus="" élevé="" de="" cellules="" viables="" par="" rapport="" au="" témoin="" (cellules="" irradiées="" non="" traitées).="" il="" est="" décrit="" dans="" la="" littérature="" que="" les="" rayonnements="" uv="" entraînent="" la="" génération="" de="" ros,="" une="" surproduction="" de="" monoxyde="" d'azote="" et="" une="" déplétion="" des="" défenses="" antioxydantes="" des="" kératinocytes="" [30].="" pour="" ces="" raisons,="" les="" polyphénols="" à="" capacité="" antioxydante="" ont="" été="" étudiés="" comme="" agents="" photoprotecteurs.="" bien="" que="" la="" plupart="" des="" études="" se="" soient="" concentrées="" sur="" la="" capacité="" photoprotectrice="" des="" polyphénols,="" elles="" n'ont="" pas="" étudié="" leur="" potentiel="" phototoxique.="" des="" études="" antérieures="" ont="" confirmé="" la="" capacité="" des="" acides="" caféique,="" férulique="" et="" p-coumarique="" à="" piéger="" les="" ros="" et="" les="" espèces="" azotées="" réactives="" (rns).="" par="" ailleurs,="" une="" protection="" contre="" les="" effets="" délétères="" des="" rayonnements="" uv="" a="" également="" été="" établie="" in="" vivo="" ou="" des="" cellules="" cutanées="" pour="" ces="" trois="" composés="" phénoliques="" [31–34].="" ces="" données="" peuvent="" expliquer="" l'augmentation="" du="" pourcentage="" de="" cellules="" viables="" lorsqu'elles="" sont="" exposées="" à="" une="" irradiation="" en="" présence="" des="" composés="" à="" l'étude.="" la="" rutine,="" comme="" les="" acides="" caféique,="" férulique="" et="" p-coumarique,="" a="" été="" testée="" négative="" dans="" le="" test="" de="" génération="" de="" ros="" et="" n'a="" pas="" induit="" de="" phototoxicité="" dans="" la="" lignée="" cellulaire="" hacat.="" il="" existe="" des="" informations="" contradictoires="" dans="" la="" littérature="" concernant="" le="" potentiel="" phototoxique="" de="" la="" rutine,="" d'où="" l'intérêt="" des="" résultats="" obtenus.="" l'évaluation="" du="" potentiel="" phototoxique="" à="" l'aide="" d'un="" système="" cellulaire="" de="" kératinocytes="" (hacat),="" a="" montré="" que="" la="" rutine="" présentait="" une="" phototoxicité="" [35].="" au="" contraire,="" en="" utilisant="" une="" configuration="" expérimentale="" qui="" utilise="" l'électrophorèse="" capillaire="" avec="" détection="" électrochimique="" et="" uv="" pour="" tester="" la="" phototoxicité="" des="" extraits="" de="" plantes="" et="" des="" composants="" en="" termes="" de="" consommation="" d'oxygène="" et="" de="" génération="" d'espèces="" réactives="" de="" l'oxygène="" lors="" de="" l'irradiation="" avec="" de="" la="" lumière="" visible,="" il="" a="" été="" possible="" de="" conclure="" que="" la="" rutine="" était="" non="" phototoxique="" [36],="" ce="" qui="" était="" en="" accord="" avec="" les="" résultats="" obtenus="" dans="" ce="" travail="" où="" la="" rutine="" ne="" présentait="" pas="" de="" photoréactivité="" car="" elle="" ne="" générait="" ni="" so="" ni="" sa="" dans="" le="" test="" de="" génération="" de="" ros.="" d'autre="" part,="" dans="" ce="" travail,="" il="" a="" également="" été="" montré="" que="" la="" rutine="" en="" elle-même="" ne="" présente="" aucun="" potentiel="" phototoxique="" dans="" la="" lignée="" cellulaire="" hacat.="" ces="" résultats="" contradictoires="" soulignent="" l'importance="" d'utiliser="" des="" conditions="" de="" test="" standardisées="" ainsi="" que="" l'utilisation="" d'une="" source="" lumineuse="" appropriée="" afin="" d'éviter="" des="" résultats="" trompeurs.="" fait="" intéressant,="" et="" malgré="" la="" similitude="" structurelle="" entre="" le="" dopac="" et="" les="" autres="" pp="" étudiés,="" le="" dopac="" a="" généré="" du="" so="" dans="" le="" test="" de="" génération="" de="" ros="" et="" a="" été="" classé="" comme="" photoréactif.="" cependant,="" lorsqu'il="" a="" été="" testé="" dans="" la="" lignée="" cellulaire="" hacat,="" le="" dopac="" s'est="" révélé="" non="" phototoxique.="" d'après="" les="" résultats="" obtenus,="" le="" dopac="" semble="" être="" photoréactif="" mais="" pas="" phototoxique,="" il="" n'est="" donc="" pas="" prévu="" que="" des="" réactions="" phototoxiques="" se="" produisent="" après="" l'application="" topique="" de="" ce="">

3. Matériels et méthodes

3.1. Réactifs

3,4-Acide dihydroxyphénylacétique (DOPAC), acide caféique, acide trans-férulique, acide p-coumarique, rutine, chlorhydrate de chlorpromazine, hydrogénophosphate disodique dodécahydraté, phosphate de sodium monobasique monohydraté, rouge neutre (NR) et diméthylsulfoxyde (DMSO) ont été achetés chez Sigma-Aldrich (Madrid, Espagne). Le chlorhydrate de quinine, la benzocaïne, le diclofénac et l'érythromycine ont été achetés chez Acofarma (Madrid, Espagne). La lignée cellulaire de kératinocytes humains immortalisés (HaCaT) a été obtenue auprès de Cell Lines Service (CLS) (Eppelheim, Allemagne). Milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 4,5 g/L de D-glucose, L-glutamine, HEPES 25 mM et DMEM avec 4,5 g/L de D-glucose, L glutamine, HEPES 25 mM sans rouge de phénol, solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS), le sérum bovin fœtal (FBS) et la trypsine EDTA ont été achetés auprès de Gibco Life Technologies (Waltham, MA, États-Unis). L'éthanol était fourni par Aga (Lisbonne, Portugal). La N, N-diméthyl-4-nitroguanidine (RNO), l'imidazole et le Nitro Blue Tetrazolium (NBT) ont été achetés chez Alfa Aesar (Kandel, Allemagne).

3.2. Absorption spectrale 

Le spectre d'absorption de chaque composé étudié a été déterminé dans la plage de 290 à 700 nm, selon la ligne directrice 101 de l'OCDE, à l'aide d'un spectrophotomètre Jasco V650 UV/VIS [37]. Les substances ont été dissoutes dans du DMSO afin d'obtenir une concentration finale de 10 µg/mL et les spectres d'absorption ont été mesurés à l'aide de cuvettes en quartz transparentes aux UV (longueur du trajet=10 mm). Chaque spectre a été corrigé pour l'absorption de base spécifique au solvant. Les coefficients d'extinction molaire (MEC) ont été calculés en utilisant les pics d'absorption les plus élevés de 290 à 700 nm [15].

3.3. Analyse des espèces réactives de l'oxygène (ROS) 

Le protocole de dosage des ROS a été établi et les études de validation ont été menées selon la procédure décrite dans la littérature [19,29]. Des solutions mères de toutes les substances testées ont été préparées à une concentration de 10 mM dans du DMSO et utilisées dans la même journée, à l'abri de la lumière. En bref, la génération d'oxygène singulet (SO) a été détectée par mesure spectrophotométrique du blanchiment de la p-nitrosodiméthylaniline (RNO) à 440 nm en utilisant l'imidazole comme accepteur sélectif d'oxygène singulet. Des échantillons, contenant le produit chimique testé (200 µM), RNO (50 µM) et de l'imidazole (50 µM) dans un tampon phosphate de sodium 20 mM (PB, pH 7,4), ont été placés dans un tube et mélangés avec un mélangeur vortex et soniqués, à l'abri de la lumière, pendant 10 min. Le mélange a été transféré dans une cellule haute performance en verre de quartz Hellma et vérifié pour la précipitation au microscope avant l'exposition à la lumière. Ensuite, les échantillons ont été irradiés à l'aide d'un simulateur solaire thermostatique Fitoclima S600PL (Aralab, Portugal), équipé de huit lampes UV-Vis Repti Glo (20 W), pendant 90 min à 25 ◦C. Après irradiation, l'absorbance a été relue à 440 nm. La génération d'anions superoxyde (SA) a été détectée en observant la réduction du nitroblue tétrazolium (NBT) en monoformazan (NBT plus), dont la formation peut être contrôlée par spectrophotométrie à 560 nm. Des échantillons contenant les composés testés (200 µM) et NBT (50 µM) dans du NaPB 20 mM ont été irradiés, et la réduction de NBT a été mesurée par l'augmentation de l'absorbance à 560 nm de la même manière que pour la détermination du SO. Les expériences ont été réalisées en triple. Le simulateur solaire utilisé étant différent des modèles préconisés, il a fallu valider les conditions d'irradiation. Un test ROS a été effectué pour s'assurer que les conditions d'irradiation satisfaisaient aux critères recommandés en utilisant des contrôles positifs (quinine) et négatifs (sulisobenzone) et des composés chimiques de référence [29]. Selon le résultat (moyenne des déterminations en triple) du test ROS, les composés polyphénoliques testés ont été classés comme substances photoréactives lorsqu'une valeur SO de 25 ou plus et/ou une valeur SA de 20 ou plus a été mesurée ; à son tour, il a été déterminé comme une substance non photoréactive lorsque des valeurs inférieures à 25 pour le SO et inférieures à 20 pour le SA ont été enregistrées [29].

3.4. Culture de cellules 

Les cellules HaCaT ont été maintenues à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 95 % d'air et 5 % de CO2 dans l'incubateur en DMEM avec 10 % de FBS et 1 % d'antibiotiques. À l'aide d'un microscope inversé, la confluence cellulaire a été observée et si les cellules atteignaient 70–80 % de confluence, une sous-culture était effectuée pour empêcher la mort cellulaire. À cette fin, le milieu de culture a été aspiré et les cellules ont été lavées avec du DPBS, 2 mL de trypsine à 0,25 % ont été ajoutés et incubés pendant 7 à 8 min à 37 ◦C dans une atmosphère à 5 % de CO2. Une fois les cellules détachées, un milieu frais a été ajouté pour bloquer l'action de la trypsine. Pour le comptage des cellules, 10 µL de suspension cellulaire ont été placés dans une chambre de Neubauer où les cellules ont été comptées. La suspension cellulaire obtenue a ensuite été subdivisée dans de nouveaux flacons avec un milieu de culture cellulaire frais. Pour la congélation des cellules, du DMSO (5 % v/v) a été utilisé comme cryo-conservateur pour empêcher la formation de cristaux pendant la phase de stockage. Afin de déterminer le temps nécessaire pour que les cellules se dupliquent, 1 × 106 cellules ont été ensemencées dans cinq flacons de 75 cm2 et incubées pendant 24 h à 37 ◦C dans une atmosphère à 5 % de CO2 pour atteindre une adhérence complète. Ensuite, les cellules de chaque flacon ont été comptées à des moments différents. Les résultats ont été tracés dans un graphique représentant le nombre de cellules en fonction du temps, à partir duquel le temps de doublement a été calculé en utilisant une analyse de régression linéaire. Le temps de doublement calculé obtenu était de 20,43 h, ce qui est cohérent avec les valeurs rapportées dans la littérature, confirmant ainsi que les cellules utilisées étaient dans des conditions de croissance normales [38]. 3.5. Essai de phototoxicité Pour l'étude de la phototoxicité, un protocole antérieur mis en place dans notre laboratoire a été suivi [24]. La hauteur de la lampe UVA/UVB Osram (240V E27) a été ajustée afin d'irradier les cellules avec une dose d'irradiation UVA de 1,7 mW/cm2 (radiomètre Cosmedico, UVM-7), selon la directive OCDE [23] . Pendant l'irradiation (10 min), les plaques ont été conservées à l'intérieur d'un récipient en polystyrène contenant un système de refroidissement à l'eau, et la température a été surveillée tout au long de la procédure. En bref, pour effectuer le test d'absorption de NR, des cellules HaCaT ont été ensemencées (2 × 104 cellules/puits) et incubées à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO2 pendant 24 h. Ensuite, le milieu a été retiré, différentes concentrations des substances à tester ont été ajoutées et les cellules ont été incubées dans les mêmes conditions pendant 1 h. Une plaque a été maintenue dans l'obscurité tandis que l'autre plaque a été irradiée pendant 10 min avec une température maintenue à 29–32 ◦C. Ensuite, le milieu cellulaire a été remplacé par du DMEM frais sans rouge de phénol et incubé pendant 18 à 22 h. Après cette période d'incubation, les cellules des deux plaques ont été lavées avec du DPBS et du DMEM complet contenant 50 µg/mL de NR a été ajouté à chaque puits et incubé pendant 3 h. Après incubation avec NR, la solution de NR a été retirée et une solution de désorption de NR (50 % d'éthanol : 1 % d'acide acétique : 49 % d'eau distillée) a été ajoutée pour extraire le colorant NR des cellules. Pour la procédure de lecture, l'absorbance a été mesurée à 540 nm. Dans chaque plaque, des témoins DMSO ont été testés. Les données de viabilité cellulaire obtenues à partir de chaque plaque ont été exprimées sous forme de rapport d'absorbance des cellules traitées aux cellules témoins de solvant et ont ensuite été utilisées pour estimer les valeurs IC50 à l'aide d'une analyse de régression linéaire. La valeur du facteur de photo-irritation (PIF) pour chaque substance d'essai a été calculée comme le rapport entre la valeur IC50 des cellules irradiées (Irr plus) et la valeur IC50 des cellules non irradiées (Irr−). Selon la ligne directrice de l'OCDE, un indice PIF inférieur à 2 prédit l'absence d'effet phototoxique, un indice PIF compris entre 2 et 5 prédit un effet phototoxique probable et un PIF supérieur à 5 prédit un effet phototoxique [23]. Les composés testés ont été évalués dans une gamme de concentrations : 12,5 ; 31,25 ; 62,5 ; 125 ; 250 ; 500 et 1000 µM. 3.6. Analyse statistique Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart type (ET) d'au moins trois expériences indépendantes réalisées en triple. Pour confirmer la normalité et l'homogénéité de la variance, le test de normalité omnibus D'Agostino – Pearson a été utilisé, puis l'analyse de variance à un facteur (ANOVA), suivie du test post hoc de Dunnett (comparaison avec des cellules témoins négatives avec solvant), était joué. Les graphiques ont été générés avec le logiciel GraphPadPrism pour Windows (version 6.0, GraphPad Software, Inc. (San Diego, CA, USA).

4. Conclusions

Dans cette étude, un test Reactive Oxygen Species (ROS) et un test 3T3 Neutral Red UptakePhototoxicity (3T3 NRU-PT) ont été utilisés pour examiner le comportement des antioxydants phénoliques naturels lorsqu'ils sont exposés à un rayonnement imitant la lumière du soleil afin d'examiner leur photoréactivité et leur phototoxicité. potentiel. Les résultats obtenus ont permis de conclure que, bien que la rutine et les acides caféique, p-coumarique et férulique absorbent le rayonnement UV-visible et présentent une MEC supérieure à 1000 L mol-1cm-1, ils sont classés comme non photoréactifs. De plus, ces composés n'ont pas induit de phototoxicité lorsqu'ils ont été testés sur la lignée cellulaire HaCaT. Les données trouvées suggèrent queces antioxydantspar eux-mêmes ne devraient pas provoquer de phototoxicité et peuvent donc être considérés comme sûrs pour une utilisation dans des formulations cosmétiques. En revanche, il a été possible d'observer une augmentation de la viabilité des cellules exposées aux rayonnements en présence de ces antioxydants révélant un éventuel effet photoprotecteur qu'il pourrait être intéressant d'étudier pour étayer leur utilisation comme éventuels agents photoprotecteurs dans les formulations cosmétiques. Dans le cas du DOPAC, ce composé s'est révélé photoréactif, bien qu'aucune phototoxicité n'ait été observée dans le test 3T3 Neutral Red Uptake. Cependant, d'autres études devraient être menées pour comprendre les mécanismes derrière la photoréactivité du DOPAC, pour assurer sa photosécurité, et aussi pour comprendre le rôle et la relation entre la structure chimique et le potentiel d'un composé à être photoréactif. Contributions des auteurs : analyse formelle, BA ; Rédaction—Préparation du brouillon original, BA ; Conceptualisation IFA, HC et JG : Ressources, IFA, HC, JMSL et JG ; Rédaction—Révision et édition, IFA, HC, JMSL et JG ; Supervision, IFA, HC et JG ; Acquisition de financement, IFA, HC, JMSL et JG Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.Financement : cette recherche n'a reçu aucun financement externe.Déclaration du comité d'examen institutionnel : non applicable. Déclaration de disponibilité : Toutes les données présentées dans cette étude sont contenues dans l'article. /04378/2020 de l'unité de recherche sur les biosciences moléculaires appliquées-UCIBIO et le projet LA/P/0140/2020 de l'AssociateLaboratory Institute for Health and Bioeconomy-i4HB et la subvention UIDB/00081/2020 financée par FCT/MCTES (PIDDAC). Conflits d'intérêts : Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.Disponibilité des échantillons : Sans objet.

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