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LP Arantes1, ML Machado1, DC Zamberlan1, TL da Silveira1, TC da Silva1, IBM da Cruz1 , EE Ribeiro2, M. Aschner3 et FAA Soares1

1Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, Brésil 2Universidade Aberta da Terceira Idade, Universidade do Estado do Amazonas, Manaus, AM, Brésil

3Département de pharmacologie moléculaire, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY, États-Unis

Cistanche a un effet anti-âge

Résumé

Le guarana (Paullinia cupana) est habituellement ingéré par les habitants de la région amazonienne et est un ingrédient clé de diverses boissons énergisantes consommées dans le monde. L'allongement de la longévité et la faible prévalence des maladies chroniques liées à l'âge ont été associés à la consommation habituelle de guarana.L'anti-âgele potentiel du guarana a également été démontré chez Caenorhabditis elegans ; cependant, les mécanismes impliqués dans ses effets ne sont pas clairs. Ici, nous avons étudié les voies putatives qui régulent les effets de l'extrait éthanolique de guarana (GEE) sur la durée de vie à l'aide de C. elegans. Les principales voies de longévité connues ont été analysées à l'aide de vers mutants et d'un test RT-qPCR (DAF-2, DAF-16, SKN-1, SIR-2.1, HSF{{6 }}). L'implication possible de la signalisation purinergique a également été étudiée. Cette étude a démontré que GEE agit à traversantioxydantactive, les voies DAF-16, HSF-1 et SKN-1, et l'orthologue du récepteur de l'adénosine humaine (ADOR-1) pour prolonger la durée de vie. GEE a également régulé à la baisse skn-1, daf-16, sir-2.1 et hsp-16.2 chez 9-C. elegans âgé d'un jour, ce qui pourrait refléter moins besoin d'activer ces gènes protecteurs en raison deantioxydanteffets. Nos résultats contribuent à la compréhension des effets du guarana in vivo, qui pourraient être utiles pour prévenir ou traiter les troubles associés au vieillissement, et suggèrent également la signalisation purinergique comme cible thérapeutique plausible pour les études de longévité.

Mots clés : Vieillissement ; Antioxydant; Guarana; Durée de vie; Produits naturels; Xanthines

Introduction

Paullinia cupana, également appelée guarana, est une plante originaire du bassin amazonien et particulièrement commune au Brésil. La poudre de ses graines est habituellement ingérée par des personnes de tous âges dans la région amazonienne principalement pour ses propriétés toniques et stimulantes (1). De plus, le guarana est un ingrédient clé de diverses boissons énergisantes consommées dans de nombreux pays (2). D'autres effets pharmacologiques rapportés du guarana incluent la perte de poids, la diminution de la synthèse plaquettaire du thromboxane, la protection contre les lésions gastriques, l'activité antioxydante et les effets anti-inflammatoires [pour examen, voir : (1)]. Cependant, lorsqu'il est consommé en excès, le guarana peut également nuire à la santé humaine, provoquant de l'anxiété, des troubles du sommeil et de la tachycardie, par exemple, en raison de sa forte teneur en caféine (2,3).

L'allongement de la longévité chez les personnes vivant à Maués, une région amazonienne du Brésil, a été associé au régime alimentaire amazonien, y compris la consommation habituelle de guarana (4). De plus, une étude épidémiologique a associé l'ingestion de guarana à une faible prévalence de maladies chroniques liées à l'âge dans la population amazonienne (5). Récemment, une étude a également démontré laanti-âgepotentiel de l'extrait de graines de guarana chez Caenorhabditis elegans (6). Cependant, les mécanismes sous-jacents aux effets du guarana sur le vieillissement n'ont pas été identifiés.

C. elegans a été un modèle approprié pour comprendre les réponses des organismes à divers composés synthétiques et naturels et leur influence sur le vieillissement et la durée de vie. Les voies biologiques vitales et de nombreux aspects du vieillissement sont analogues chez les nématodes et les mammifères, y compris les humains (7).

Étant donné que le pourcentage de personnes âgées augmente dans le monde, accompagné d'une fréquence accrue de maladies liées à l'âge, il est essentiel d'identifier des thérapies efficaces et des cibles thérapeutiques susceptibles d'améliorer la qualité de vie (8). Ici, nous avons étudié les voies putatives qui régulent les effets du guarana sur la durée de vie en utilisant C. elegans.

Matériel et méthodes

Produits chimiques

Gélose, éthanol (96 %), chloroforme, cholestérol, FUDR (5-fluoro-20-désoxyuridine), inhibiteur de protéase, cocktails d'inhibiteurs de phosphatase, amorces de réaction en chaîne par polymérase (PCR) et albumine de sérum bovin (BSA) ont été achetés chez Sigma (USA). Les amorces TaqMans utilisées pour l'analyse qRT-PCR et le Trizol ont été achetés auprès d'Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific Corporation (USA). Tous les autres réactifs ont été achetés chez Synth (Brésil).

Souches et entretien

Les souches utilisées dans cette étude étaient Bristol N2 (type sauvage) ; CB1370, daf-2 (e1370) III ; CF1038, daf-16 (mu86) I ; EU1, skn-1(zu67); PS3551, hsf-1(sy441) I ; TK22, mev-1(kn1) ; et VC199, sir-2.1(ok434), obtenu auprès du Caenorhabditis Genetics Center (CGC), Université du Minnesota, États-Unis, ainsi que Escherichia coli OP50. La souche EG6890, ador-1 (ox489), a été gracieusement fournie par le laboratoire du Dr Erik Jorgensen (Université de l'Utah, États-Unis). Cette souche a une délétion de 1 kb en amont et des trois premiers exons du gène ador-1, et a été croisée 6 fois ; Le gène ador-1 code pour un orthologue du récepteur de l'adénosine humaine (9).

Les nématodes ont été maintenus et dosés à 20 degrés sur des plaques de gélose au milieu de croissance des nématodes (NGM) portant un tapis de E. coli OP50 (10). La synchronisation des cultures de nématodes a été réalisée par un traitement de blanchiment des hermaphrodites gravides et les œufs ont pu éclore pendant une nuit dans un tampon M9 (42 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 8,5 mM NaCl et 1 mM MgSO4) (10).

Matériel végétal et préparation d'extraits

La poudre de graines grillées de Paullinia cupana Kunth var. sorbilis (Mart.), le guarana, a été isolé et fourni par EMBRAPA Oriental (Agropecuary Research Brazilian Enterprise) situé en Amazonie occidentale à Maués, Amazonas, Brésil. L'extrait hydro-alcoolique a été obtenu comme décrit par ailleurs (11). Brièvement, l'extrait a été produit en utilisant 70 pour cent d'éthanol. Après 24 heures, la solution résultante a été filtrée, l'éthanol a été éliminé et l'extrait a été lyophilisé. Les xanthines et catéchines prédominantes présentes dans l'extrait de guarana ont été analysées par HPLC, montrant les concentrations suivantes : caféine=12.240 mg/g, théobromine=6.733 mg/g et catéchines totales{{ 9}}.336 mg/g (11).

Traitement des vers

Des plaques NGM portant un tapis d'E. coli OP50 (comme source de nourriture) ont été préalablement incubées à 37 degrés pendant la nuit. L'extrait éthanolique de guarana lyophilisé (GEE) a été dissous dans de l'eau distillée froide autoclavée (121 degrés, 30 min) et étalé sur les plaques à des concentrations finales de 100, 500 et 1,000 mg/mL d'agar. Les larves L1 synchronisées (10) ont été transférées avec une pipette à la surface des plaques de traitement et cultivées jusqu'à l'âge adulte à 20 degrés.

Durée de vie

Les analyses de durée de vie ont commencé sur les larves L4 dans des plaques NGM ensemencées avec E. coli OP5 0 en l'absence ou en présence de GEE (jour 0). Les animaux ont été transférés dans des plaques fraîches avec ou sans GEE tous les deux jours pour éviter la confusion des générations, et marqués en même temps jusqu'à la mort. L'absence de réponse à un stimulus mécanique était considérée comme un décès. Les vers étaient censurés s'ils rampaient hors de la plaque, présentaient des organes internes extrudés ou mouraient à cause de l'éclosion de la progéniture à l'intérieur de l'utérus. Les tests de durée de vie ont été répétés trois fois avec 60 à 120 vers par test. Grâce à des souches mutantes, les principales voies de longévité connues ont été analysées (12,13) : i) daf-2 et daf-16, l'insuline/facteur de croissance analogue à l'insuline (IGF){{11} } (IIS), que le récepteur DAF-2 signale via une voie PI3-kinase/AKT conservée et régule à la baisse DAF-16/FOXO, responsable de la promotion de l'expression des gènes qui conférer une longévité prolongée et une meilleure résistance au stress ; ii) skn-1, qui est lié aux protéines de la famille Nrf des vertébrés et favorise l'expression d'enzymes de détoxification en réponse au stress oxydatif, comme la glutathion-S-transférase ; iii) sir-2.1, qui code pour une protéine de type histone désacétylase qui intègre l'état métabolique à la durée de vie et est associée à la restriction calorique ; et iv) hsf-1, qui code pour le facteur de transcription de choc thermique-1 (HSF-1) et induit l'activation de divers gènes de choc thermique ou chaperons impliqués dans le maintien de l'homéostasie conformationnelle de protéines parmi d'autres fonctions importantes. Une relation possible entre la longévité et la signalisation purinergique a également été étudiée à travers la souche mutante ador-1.

Comme les bactéries jouent un rôle dans la mortalité de C. elegans, la croissance d'E. coli OP50 a été évaluée en présence ou en l'absence de GEE pour déterminer si les effets bénéfiques pouvaient être une réponse à une propriété antimicrobienne. L'absorbance des bactéries a été mesurée pendant une période de 12-h en milieu liquide (14).

Durée de vie

Les paramètres de comportement liés à l'étendue de la santé ont été évalués (15). Le pompage pharyngé a été évalué avec un microscope Nikon E200 en observant le nombre de contractions pharyngées pendant un intervalle de 60- s chez les jeunes adultes de type sauvage.

La fréquence des battements a été sélectionnée pour l'analyse de la locomotion. De jeunes adultes de type sauvage provenant de traitements témoins ou GEE ont été prélevés individuellement et placés dans une goutte de M9. Les vers ont été autorisés à s'adapter pendant 1 min, puis le nombre de coups a été quantifié avec un microscope Nikon E200 pendant un intervalle de 20- s. Un thrash a été défini comme un changement dans la direction de la flexion au milieu du corps.

Les analyses ont été effectuées dans trois essais indépendants. Trente nématodes ont été examinés par groupe.

Isolement d'ARN et réaction en chaîne par polymérase en temps réel (RT-qPCR)

Les vers de type sauvage chez les vers adultes âgés de 9-jour ont été analysés pour l'expression génique liée à la longévité et aux réponses au stress oxydatif. Après l'âge adulte, les vers ont été transférés tous les deux jours sur des plaques contenant 150 mM de FUDR (5-fluoro-20-désoxyuridine) pour inhiber la reproduction, en présence ou en l'absence de GEE. L'ARN de 20 000 vers par condition a été isolé à l'aide de Trizol suivi d'une extraction au chloroforme, comme décrit précédemment (16) et 1 mg d'ARN d'entrée a été transcrit en ADNc par le kit de transcription inverse d'ADNc haute capacité d'Applied Biosystems (Applied Biosystems , ETATS-UNIS). L'analyse de l'expression a été effectuée par analyse personnalisée TaqMans Array en utilisant les tests d'expression génique TaqMans correspondants pour la superoxyde dismutase mitochondriale sod-3 (Ce02404515_g1), la glutathion-S-transférase gst-4 (Ce{ {16}}g1), gamma glutamylcystéine synthétase gcs-1 (Ce02436726_g1), daf-16 (Ce02422835_g1), monsieur-2.1 (Ce02 459018_g1), hsf-1 (Ce02423758_m1), protéine de choc thermique hsp-16.2 (Ce02506738_s1) et skn{ {35}} (Ce02407445_g1) (Biosystèmes appliqués). L'expression du gène cible a été normalisée aux valeurs d'expression de l'actine afd-1 (Ce02414 573_m1). L'expression relative de chaque gène a été déterminée par la méthode 2 DDCt (17) et les données sont rapportées sous forme de changement de pli dans les niveaux d'ARNm par rapport à afd-1. Cette expérience a été réalisée dans trois préparations de vers indépendantes, chacune en trois exemplaires.

analyses statistiques

Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de GraphPad Prism version 5 pour Windows (GraphPad Software, USA). Les résultats sont rapportés sous forme de moyennes ± ET d'au moins trois expériences individuelles. Le test t de Student a été utilisé pour comparer des paires de groupes, tandis qu'une ANOVA à un ou deux facteurs suivie du test post hoc de Bonferroni a été utilisée pour comparer trois groupes ou plus. Toutes les courbes de survie ont été analysées par le test du log-rank (Mantel-Cox). La signification statistique a été déterminée comme Po0.05.

Résultats

Dans notre étude, le C. elegans de type sauvage témoin avait une durée de vie moyenne de 11 jours et une durée de vie maximale de 14 jours. Dans les milieux contenant du GEE, la durée de vie moyenne des vers de type sauvage a été étendue à 13 jours à 100 mg/mL (18 %) et à 15 jours à 500 et 1 000 mg/mL (36 %). La durée de vie maximale a été prolongée de 28 % en moyenne aux trois concentrations testées (tableau 1). Il n'y avait aucune différence dans la croissance d'E. coli en présence ou en l'absence de 1,000 mg/mL de GEE (données non présentées).

La durée de vie des vers a également été prolongée après le traitement GEE. L'extrait a retardé le déclin lié à l'âge du pompage pharyngé (100, 500 et 1,000 mg/mL) et des thrashes (1,000 mg/mL) à partir du 9e jour de l'âge adulte ( Figure 1 A et B). En conséquence, la concentration de 1,000 mg/mL de GEE et des échantillons de vers adultes de 9-jour ont été sélectionnés pour une analyse plus approfondie.

L'extrait de GEE (1,000 mg/mL) a prolongé la durée de vie moyenne des mutants mev-1 de 44 % et la durée de vie maximale de 77,8 % (tableau 1), montrant un lien entreantioxydant

Les tests de durée de vie ont été effectués à 20 degrés. La durée de vie maximale est représentée comme la durée de vie moyenne des 10 % les plus anciens de la population de vers. Chaque expérience a été répétée trois fois en commençant avec au moins 60 nématodes par groupe. Les données sont rapportées sous forme de moyenne ± SD. *Po0,05 par rapport au groupe non traité (test du log-rank de Mantel-Cox).

Figure 1. Effets de l'extrait éthanolique de guarana (GEE) sur les paramètres comportementaux liés à la santé. Débit de pompage pharyngé (A) et

fréquence de battement (B) au cours du vieillissement chez les vers de type sauvage. Les données sont rapportées sous forme de moyenne ± SD (n=30 vers par groupe). *P o0.05 par rapport au contrôle (ANOVA unidirectionnelle suivie d'un test de comparaison multiple de Bonferroni.

etanti-âgeActivités. L'extrait a également prolongé la durée de vie moyenne des mutants daf-2 et sir 2.1, établissant que l'extrait n'a pas agi par ces voies pour favoriser l'extension de la durée de vie. En revanche, le traitement n'a pas prolongé la durée de vie des mutants daf-16, skn-1, hsf-1 et ador-1 (tableau 1).

Les analyses PCR ont évalué la modulation génique par GEE (tableau 2). GEE à 1 000 mg/mL skn régulé à la baisse-1, daf-16, sir-2.1 et hsp-16.2 dans {{9 }}adultes d'un jour. Aucun effet n'a été observé sur les expressions hsf-1, gst-4, gcs-1 et sod-3.

Discussion

Comme démontré précédemment (1), dans notre étude, l'extrait de guarana a également prolongé la durée de vie et la durée de vie de C. elegans de type sauvage. Ainsi, les voies putatives qui pourraient être impliquées dans saanti-âgeeffets ont été étudiés. Ici,anti-âgeles effets ont été démontrés à une concentration plus élevée de l'extrait (1,000 vs 300 mg/mL comme précédemment démontré). Cet écart peut être dû à des différences dans la préparation de l'extrait (hydro-alcoolique vs extrait aqueux)

Tableau 2. Expression de l'ARNm de changement de pli des gènes liés à la longévité et au stress oxydatif chez les vers adultes de type sauvage 9- âgés d'un jour traités avec de l'extrait éthanolique de guarana (GEE)

Cette expérience a été évaluée par RT-qPCR et réalisée dans trois préparations de vers indépendantes, chacune en triple exemplaire. Les données sont rapportées en tant que moyens de changement de pli dans les niveaux d'ARNm par rapport à afd-1 (actine) ± SD. *Po0.05 par rapport au non traité (ANOVA à deux facteurs suivi du test de comparaison multiple de Bonferroni).

et la méthode de livraison (agar vs milieu liquide) et peut être le résultat d'une dérive naturelle de la variation génétique dans la population de vers (18,19).

Le stress oxydatif semble être un facteur majeur limitant la durée de vie à la fois chez C. elegans et chez l'homme et est associé à de nombreuses maladies liées à l'âge (20,21), ce qui oriente l'attention versantioxydantcomposés ayant des effets in vivo. Pour étudier plus avant si GEE pourrait prolonger la durée de vie grâce àantioxydantactivité, son effet sur les vers mev-1 a été évalué. Cette souche est caractérisée par une surproduction de superoxyde et a une durée de vie plus courte que la souche de type sauvage (22). Conforme à ce qui a été décrit précédemmentantioxydanteffets de l'extrait de guarana (6), le traitement au GEE a significativement prolongé la durée de vie moyenne et maximale des vers mev-1.

En outre, les voies DAF-16, HSF-1 et SKN-1, impliquées dans la signalisation insuline/IGF (IIS), semblaient essentielles pour l'extension de la durée de vie médiée par GEE. Un IIS réduit est associé à la longévité et à l'adaptation aux conditions environnementales défavorables chez C. elegans, la drosophile, les mammifères et peut-être les humains (13). HSF-1 fonctionne en coopération avec DAF-16 pour activer l'expression de gènes cibles communs, y compris la famille des sHsp (petits gènes de protéines de choc thermique) (23). SKN-1/Nrf intègre IIS et régule la réponse au stress oxydatif et l'expression des gènes de détoxification (24).

DAF-16, HSF-1 et SKN-1 pourraient également jouer un rôle dans l'extension de la durée de vie et l'homéostasie des protéines (25). Le DAF-16 est impliqué dans la formation d'agrégats de protéines de haut poids moléculaire moins toxiques (26), et bien que le HSF-1 régule l'activité de désagrégation des protéines en libérant de petits agrégats toxiques, il pourrait avoir un effet bénéfique en contribuant à clairance des protéines par métabolisme enzymatique (27,28). SKN-1 est surtout connu comme un régulateur deantioxydantet la défense xénobiotique, mais il a également été impliqué dans des fonctions supplémentaires telles que la protéostase et la régulation métabolique (24).

Les méthylxanthines, comme la caféine, sont les principaux composants du guarana et il est bien connu que ces composés peuvent agir via les récepteurs de l'adénosine chez les mammifères (29). La caféine a été associée à des effets bénéfiques, notamment des effets liés au vieillissement (30,31) et à l'amélioration des phénotypes de déficience cognitive en antagonisant les récepteurs de l'adénosine A1 et A2A chez les rongeurs (32). Ainsi, nous avons testé si l'extension de la durée de vie induite par le GEE pouvait également dépendre d'ADOR-1, un homologue du récepteur de l'adénosine (33). Nos résultats ont indiqué que les vers ador-1(ox489) n'ont pas montré de durée de vie prolongée, démontrant, pour la première fois, un rôle possible du système purinergique dans l'extension de la durée de vie. En conséquence, la signalisation purinergique peut être étudiée de manière rentable à l'avenir en tant que cible potentielle pour la modulation de la longévité.

Bien que le GEE ait des niveaux élevés de caféine et que des études antérieures aient décrit les effets de la caféine sur les vers (34–36), leanti-âgeles effets du GEE pourraient être liés aux effets synergiques de différents composés. La concentration de caféine dans l'extrait est bien inférieure à la concentration efficace précédemment démontrée et il a été démontré que l'extrait alcaloïde de guarana n'avait pas les mêmes effets bénéfiques (6). Par ailleurs, les données de la littérature montrent que les extraits pourraient avoir des activités pharmacologiques plus importantes que les composés isolés (37,38).

La régulation à la baisse de skn-1, daf-16, sir-2.1 et hsp-16.2 chez 9-C. elegans âgés d'un jour traités avec GEE pourrait reflètent moins le besoin d'activer ces gènes pour réparer les dommages cellulaires au cours du vieillissement par rapport aux vers non traités, possible en raison de laantioxydanteffets exercés par l'extrait (39,40).

Ainsi, cette étude a montré que lesanti-âgeles effets du guarana sont médiés parantioxydantactivité et voies DAF-16, HSF-1 et SKN-1. De plus, ADOR-1 était également nécessaire pour les effets du GEE sur la durée de vie, indiquant une implication possible du système purinergique dans la longévité. Nos résultats contribuent à la compréhension des effets du guarana in vivo, qui pourraient être utiles pour prévenir ou traiter les troubles associés au vieillissement, et suggèrent la signalisation purinergique comme cible thérapeutique plausible pour les études de longévité.

Remerciements

Les auteurs remercient Caenorhabditis Genetics

Center (CGC) de l'Université du Minnesota, USA pour avoir fourni des souches de vers et au laboratoire du Dr Erik Jorgensen (Université de l'Utah, USA) pour avoir aimablement fourni la souche EG6890. Cette étude a été soutenue par Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brésil (CNPq), Coordenac¸ão de Aperfeic¸oamento de Pessoal a Nível Superior, Brésil (CAPES), PRONEM/FAPERGS/ CNPq et MCTI/CNPq #472669/{{ 3}} et #475896/ 2012-2. Michael Aschner a été soutenu en partie par la subvention NIH R01 ES10563. Les sources de financement n'ont pas été impliquées

dans la conception de l'étude ou l'interprétation des données.