La norwogonine atténue le stress oxydatif induit par l'hypoxie et l'apoptose dans les cellules PC12

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Résumé

Contexte : La norwogonine est une flavone naturelle avec trois groupes hydroxyles phénoliques dans la structure squelettique et possède une excellenteactivité antioxydante. Cependant, l'effet neuroprotecteur de la norwogonine reste incertain. Ici, nous avons étudié la capacité protectrice de la norwogonine contre les dommages oxydatifs provoqués par l'hypoxie dans les cellules PC12. Méthodes : La viabilité cellulaire et l'apoptose ont été examinées par le test MTT et la coloration à l'annexine V-FITC/PI, respectivement. La teneur en espèces réactives de l'oxygène (ROS) a été mesurée à l'aide du test DCFH-DA. Lactate déshydrogénase (LDH), malondialdéhyde (MDA) etenzyme antioxydanteles niveaux ont été déterminés à l'aide de kits commerciaux. L'expression de gènes et de protéines apparentés a été mesurée respectivement par PCR quantitative en temps réel et Western blot. Résultats : Nous avons constaté que la norwogonine atténuait les lésions induites par l'hypoxie dans les cellules PC12 en augmentant la viabilité cellulaire, en réduisant la libération de LDH et en améliorant les modifications de la morphologie cellulaire. Norwogonin a également agi comme unantioxydantNTen piégeant les ROS, en réduisant la production de MDA, en maintenant les activités de la superoxyde dismutase (SOD), de la catalase (CAT) et de la glutathion peroxydase (GPx) et en diminuant les niveaux d'expression de HIF-1 et de VEGF. De plus, la wogonine a empêché l'apoptose cellulaire en inhibant les niveaux d'expression de la caspase-3, du cytochrome c et de Bax tout en augmentant les niveaux d'expression de Bcl-2 et le rapport Bcl-2/Bax. Conclusions : La norwogonine atténue les lésions induites par l'hypoxie dans les cellules PC12 en éteignant les ROS, en maintenant les activités des enzymes antioxydantes et en inhibant la voie de l'apoptose mitochondriale.

Mots-clés : norwogonine,Activité antioxydante, Hypoxie, Stress oxydatif,Apoptose

Arrière plan

Les organismes aérobies ont besoin d'oxygène (O2) pour produire de l'énergie. L'hypoxie est définie comme un apport insuffisant d'O2 pour maintenir la fonction cellulaire dans les tissus et survient souvent dans certaines situations physiologiques telles que la haute altitude [1], et dans de nombreuses situations pathologiques telles que les accidents vasculaires cérébraux [2]. Le cerveau est particulièrement sensible aux lésions induites par l'hypoxie en raison de sa forte consommation d'oxygène, riche en acides gras insaturés et faiblecapacité antioxydante[3]. De plus en plus de preuves ont indiqué que l'hypoxie peut induire des effets indésirables sur le cerveau [4–6].

Linlin Jing, Rongmin Gao, Jie Zhang, Dongmei Zhang, Jin Shao, Zhengping Jia et Huiping Ma

Département de pharmacie, 940th Hospital of Joint Logistics Support force of PLA, Lanzhou 730050, Gansu, Chine

Le stress oxydatif et l'apoptose sont considérés comme deux facteurs contributifs aux lésions induites par l'hypoxie [7, 8]. Il a été rapporté que l'exposition à l'hypoxie augmente la production d'espèces réactives de l'oxygène intracellulaire (ROS), ce qui facilite le stress oxydatif. Un excès de ROS, tels que l'anion superoxyde (O2−˙ ), le peroxyde d'hydrogène (H2O2) et le radical hydroxyle (HO•), entraîne des changements cellulaires structurels et fonctionnels en attaquant les lipides, les membranes, les protéines et l'ADN, et provoque par la suite des dommages cellulaires [ 9].

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Simultanément, la surproduction de ROS facilite également l'ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale (mPTP) [10] et le transfert des protéines pro-apoptose vers la membrane mitochondriale externe, ce qui induit la dépolarisation des membranes mitochondriales et la libération de cytochrome c [11]. Ces changements provoquent finalement une apoptose dépendante des mitochondries [12]. Ainsi, on pense que les antioxydants capables d'inhiber ou d'éliminer les ROS excessifs peuvent exercer leur effet protecteur en atténuant le stress oxydatif et l'apoptose induits par l'hypoxie. De nombreuses études ont prouvé que les suppléments antioxydants comme la vitamine C [13], les isoflavones [8] et les radicaux nitroxydes [14] peuvent limiter les lésions induites par l'hypoxie in vitro et in vivo. Les flavonoïdes sont une classe vaste et diversifiée de métabolites secondaires végétaux omniprésents. Ils sont toujours considérés comme un excellent antioxydant naturel avec la capacité de piéger les radicaux libres et d'inhiber la peroxydation des lipides.

Actuellement, de plus en plus d'attention est portée à cette classe de composés en raison de leurs effets bénéfiques sur la santé humaine. Il a été démontré que les flavonoïdes possèdent un large éventail d'actions pharmacologiques, telles qu'une activité anti-inflammatoire, antinociceptive et neuroprotectrice, etc., qui peuvent toutes être attribuées à leurs activités antioxydantes [15]. De nombreuses études ont indiqué que les flavonoïdes présentent d'excellents effets protecteurs sur l'échec induit par l'hypoxie. Par exemple, la rutine a un fort effet neuroprotecteur contre la mort des cellules ganglionnaires rétiniennes induite par l'hypoxie [16]. Une étude récente démontre également que la rutine peut atténuer les dommages causés par l'hypoxie induite par le chlorure de cobalt en inhibant le stress oxydatif et l'apoptose dans les cellules H9c2 [17]. De plus, Liu et al suggèrent que la nobilétine (3′,4′,5,6, 7,8-hexaméthoxy flavone) atténue les lésions I/R myocardiques via l'activation de la voie Akt/GSK-3 dans la cellule H9c2 [18]. De plus, l'acacétine peut protéger les cardiomyocytes de rat et les cardiomyoblastes H9C2 contre les lésions induites par l'hypoxie/réoxygénation via l'activation médiée par l'AMPK de la voie de signalisation Nrf2 [19].

La norwogonine (5,7,8-trihydroxy flavone, Fig. 1) est une flavone pharmacologiquement active séparée de la racine de Scutellaria baicalensis Georgi ("Huang Qin" en chinois), une herbe traditionnelle chinoise utilisée pour traiter la grippe et le cancer [20, 21]. Cependant, des études limitées ont été rapportées sur les activités biologiques de la norwogonine en raison de ses faibles niveaux dans les plantes naturelles. Afin de résoudre ce problème, plusieurs méthodes de synthèse de norwogonine sont rapportées [22, 23].

Notre étude précédente a également établi une méthode simple pour obtenir la norwogonine à partir de la chrysine en quatre étapes [24]. Ces recherches ont positivement influencé l'évaluation ultérieure des activités biologiques de la norwogonine. Des études ont révélé que la norwogonine possède des activités antioxydantes [25], anticancéreuses [26, 27], antivirales [28] et antimicrobiennes [29] et inhibe la production de ROS stimulée par le cyanure [30]. Cependant, on ne sait pas si la norwogonine a des capacités protectrices contre les lésions induites par l'hypoxie. Le but de la présente étude était d'étudier les effets protecteurs de la norwogonine contre le stress oxydatif induit par l'hypoxie et l'apoptose dans les cellules PC12.

Méthodes

Matériaux et réactifs

La norwogonine (pureté supérieure ou égale à 98 %) a été synthétisée selon notre méthode rapportée précédemment [24]. La rutine (pureté supérieure ou égale à 96 %) a été achetée auprès de Ci Yuan Biotechnology Co., Ltd. (Xian, Shannxi, Chine). La norwogonine et la rutine ont été dissoutes dans du diméthylsulfoxyde stérile (DMSO), stockées à -20 degrés et diluées dans le milieu de culture cellulaire immédiatement avant utilisation. Le milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), le sérum bovin fœtal (FBS), la streptomycine et la pénicilline ont été achetés auprès de Solarbio co., Ltd. (Pékin, Chine).

Les kits de malondialdéhyde (MDA), de lactate déshydrogénase (LDH), de superoxyde dismutase (SOD), de catalase (CAT) et de glutathion peroxydase (GPx) ont été obtenus auprès du Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Jiangsu, Chine). Diacétate de 2′,7′-dichlorure d'hydrofluorescéine (DCFH-DA) et (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5- diphényltétrazolium bromure) tétrazolium (MTT) a été obtenu auprès de Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO, USA). Anticorps primaires contre le facteur inductible par l'hypoxie-1 (HIF-1), le facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF), le lymphome à cellules B-2 (Bcl-2), Bcl{{17 }} protéine X associée (Bax), Caspase-3, Cytochrome C et -actine ont tous été achetés auprès d'Abcam (Cambridge, Royaume-Uni). Les anticorps secondaires ont été obtenus auprès de ZsBio Company (Pékin, Chine).

Un kit d'analyse de l'apoptose a été obtenu auprès du Beyotime Institute of Biotechnology (Jiangsu, Chine). Tous les produits chimiques et solvants étaient de qualité analytique et ont été obtenus auprès d'un fournisseur commercial en Chine. Culture cellulaire Les cellules PC12 ont été achetées auprès de la banque cellulaire de l'Académie chinoise des sciences (TCR 9, Shanghai, Chine) et maintenues dans du DMEM avec 10 % (v/v) de FBS, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycines à 37 degrés dans un incubateur humidifié contenant 5 pour cent de CO2. Pour évaluer la cytotoxicité de la norwogonine, des cellules PC12 (passage 4 ~ 6) ont été pré-incubées avec différentes concentrations (10− 8 , 10− 7, 10− 6, 10− 5, 10− 4 mol/L) de norwogonine pendant 1 h puis mise en culture pendant 24 h. Exposition à l'hypoxie Pour induire un modèle de lésion par hypoxie cellulaire, les cellules PC12 ont été soumises à un environnement d'hypoxie (1 % O2, 5 % CO2 et 94 % N2) à 37 degrés pendant 24 h dans une chambre humidifiée. Les cellules témoins normoxiques ont été cultivées à 37 degrés dans un incubateur à 5 % de CO2 pendant 24 h.

Pour évaluer l'effet protecteur de la norwogonine contre les lésions induites par l'hypoxie, des cellules PC12 ont été pré-incubées avec différentes concentrations (10− 8, 10− 7, 10− 6, 10− 5 mol/ L) de norwogonine pendant 1 h avant le traitement hypoxique. Viabilité cellulaire La viabilité cellulaire a été mesurée par dosage MTT comme décrit précédemment [31]. En bref, des cellules PC12 (1 × 105 cellules/mL) ont été ensemencées dans des plaques de culture à 96 puits. Ensuite, différentes concentrations de norwogonine ont été ajoutées aux puits. Un volume égal de DMSO a été ajouté aux puits témoins. La concentration finale de DMSO dans le milieu de culture cellulaire est de 0,1 %. Après incubation dans des conditions normoxiques ou hypoxiques, 10 μL de MTT (5,0 mg/mL) ont été ajoutés à chaque puits, suivis d'une incubation à 37 degrés pendant 4 h. Ensuite, le surnageant avec du MTT a été éliminé et le produit formazan a été dissous dans 100 μL de DMSO. L'absorbance a été mesurée sur un lecteur de microplaques SpectraMax i3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) à 570 nm. Les résultats ont été exprimés en pourcentage relatif du groupe témoin. Les cellules PC12 colorées à l'hématoxyline et à l'éosine (HE) ensemencées sur des lamelles en verre ont été incubées pendant 24 h avant d'être traitées avec de la norwogonine de la même manière que celle décrite ci-dessus.

Le milieu a été retiré et les lamelles de verre ont été lavées avec du PBS froid, suivies d'une fixation avec du méthanol pendant 10 min à température ambiante, puis lavées avec du PBS froid trois fois pendant 5 min. Enfin, les cellules ont été colorées selon le protocole de coloration HE [32]. Les analyses de la cellule ont été réalisées à l'aide d'un microscope OLYMPUS IX73 (100x) afin de vérifier les changements morphologiques cellulaires. Les images numériques ont été obtenues à l'aide de la caméra numérique DXM 1200 C (Nikon) associée au microscope. Teneur en ROS Le niveau de ROS intracellulaire dans les cellules PC12 a été déterminé à l'aide du test DCFH-DA [33]. En bref, des cellules PC12 (1 × 105 cellules/mL) ont été ensemencées dans des plaques à puits 6-. Après traitement hypoxique, les cellules PC12 ont été lavées avec du PBS puis ont été incubées dans le milieu de culture contenant 10 μM de DCFH-DA pendant 30 min dans l'obscurité à 37 degrés. Les cellules ont été observées avec un microscope à fluorescence inversé Olympus (Tokyo, Japon) et ont été analysées par un cytomètre en flux Bec ton Dickinson FACScan (BD Biosciences, CA, USA) avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'onde d'émission de 525 nm. Le niveau de ROS a été exprimé en pourcentage relatif du contrôle. Fuite de LDH, teneur en MDA et activité enzymatique antioxydante Des cellules PC12 (1 × 105 cellules/mL) ont été ensemencées dans une boîte de 90 mm. Après le traitement de l'hypoxie comme décrit ci-dessus, 50 μL de surnageant de culture de chaque boîte ont été collectés et l'activité LDH dans le milieu a été détectée à l'aide de kits de dosage commerciaux (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, Chine) et a été exprimée en U/mL. Les cellules PC12 ont été récoltées et homogénéisées après deux lavages avec du PBS froid. La concentration de protéines totales a été mesurée par le kit de dosage de protéines BCA. La teneur en MDA et l'activité enzymatique antioxydante ont été déterminées à l'aide de kits de dosage commerciaux (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, Chine).

La teneur en MDA a été présentée en nmol/mg de protéine. Les activités de SOD, CAT et GPx ont été présentées en U/mg de protéine. Apoptose cellulaire (coloration à l'annexine-V/PI) Après traitement par hypoxie, les cellules PC12 ont été récoltées, lavées deux fois avec du PBS froid, puis mises en suspension avec un tampon de liaison. Les cellules ont été traitées avec la solution d'annexine V-FITC et PI selon le protocole du fabricant (Beyotime, Shanghai, Chine). Les collectes de données ont été effectuées à l'aide du cytomètre en flux Becton Dickinson FACScan (BD Biosciences, CA, USA). Analyse PCR quantitative en temps réel L'ARN total des cellules PC12 a été extrait à l'aide du réactif Trizol (Takara, Dalian, Chine) et converti en ADNc à l'aide du kit de réactifs PrimeScript TM RT (AK4301,

Takara, Dalian, Chine). L'ADNc codant pour le gène HIF-1, VEGF, Bcl-2, Bax, caspase-3, cytochrome C et glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) a été amplifié par un réel quantitatif. PCR en temps réel utilisant un système de détection en temps réel 7300 (Applied Biosystems, CA, USA). Les amorces utilisées sont présentées dans le tableau 1. Les conditions de cycle de PCR étaient de 95 degrés pendant 30 s, suivies de 40 cycles de 95 degrés pendant 5 s et de 60 degrés pendant 31 s. Les niveaux d'ARNm ont été calculés à l'aide de la méthode 2-ΔΔCt et normalisés à GAPDH, qui est le gène de référence. Les cellules Western blot PC12 ont été récoltées et homogénéisées dans des agents RIPA. La concentration des protéines totales a été quantifiée à l'aide du kit de dosage des protéines BCA. 30 ug d'échantillons ont été résolus par électrophorèse SDS-PAGE à 12 %, puis transférés sur des membranes de fluorure de polyvinylidène (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, USA).

Les membranes ont été bloquées avec du lait en poudre écrémé à 5 % dans du tampon TBST pendant 1 h à température ambiante et incubées avec des anticorps primaires : anti-HIF-1 (1:300, ab179483, Abcam, Royaume-Uni), anti-VEGF (1:1000, ab46154, Abcam, Royaume-Uni), anti-Bcl-2 (1:1000, ab59348, Abcam, Royaume-Uni), anti-Bax (1:500, ab32503, Abcam, UK), anti caspase-3 (1:300, ab44976, Abcam, UK), anti cytochrome C (1:1000, ab13575, Abcam, UK) et anti- -actine (1:2000, ab8227 , Abcam, Royaume-Uni) à 4 degrés pendant la nuit. Ensuite, les membranes ont été lavées et incubées avec des anticorps secondaires (1:2000, ZsBio, Pékin, Chine) pendant 1 h à température ambiante. Les bandes immunoréactives ont été visualisées à l'aide de réactifs de chimiluminescence améliorée (ECL). Les intensités relatives des bandes ont été normalisées par rapport au contrôle interne -actine et analysées à l'aide d'Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA).

analyses statistiques

Les résultats ont été exprimés en moyenne ± écart-type dérivé d'au moins trois expériences indépendantes. La différence entre les groupes a été analysée à l'aide d'une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) suivie du test post hoc de Student-Newman-Keuls. Une valeur P <0.05 a="" été="" considérée="" comme="" statistiquement="">

Résultats

La norwogonine protège les cellules PC12 contre les lésions induites par l'hypoxie

Tout d'abord, pour empêcher l'activité proliférative de la norwogonine, sa cytotoxicité sur les cellules PC12 normales a été déterminée à l'aide d'un test MTT. Comme le montre la figure 2a, la prolifération cellulaire n'a pas été significativement modifiée après le traitement par la norwogonine à des concentrations de 1 × 10− 8 -1 × 10− 5 mol/L (P > 0,05 ). Cependant, la viabilité cellulaire a diminué de manière significative lorsque la concentration de norwogonine a été augmentée à 1 × 10− 4 mol/L (P < 0,05).="" les="" résultats="" ont="" indiqué="" que="" la="" norwogonine="" ne="" présentait="" pas="" de="" toxicité="" ni="" d'activité="" proliférative="" sur="" les="" cellules="" pc12="" aux="" concentrations="" de="" 1="" ×="" 10−="" 8="" -1="" ×="" 10−="" 5="">

Ensuite, nous avons examiné l'effet protecteur de la norwogonine contre les lésions des cellules PC12 induites par l'hypoxie. Comme le montre la figure 2b, par rapport au groupe témoin, la viabilité cellulaire dans le groupe hypoxie a été réduite à 58,71 % (P <0.01). par="" rapport="" au="" traitement="" hypoxique,="" prétraité="" avec="" 1="" ×="" 10−="" 8="" ,="" 1="" ×="" 10−="" 7="" et="" 1="" ×="" 10−="" 6="" mol/l="" de="" norwogonine="" pc12="" protégée="" en="" fonction="" de="" la="" dose="" cellules="" contre="" les="" lésions="" induites="" par="" l'hypoxie,="" récupérant="" la="" viabilité="" cellulaire="" de="" 58,71="" à="" 62,79="" %="" (p="">< 0,05),="" 66,68="" %="" (p="">< 0,01)="" et="" 69,88="" %="" (p="">< 0,01),="" respectivement.="" le="" prétraitement="" avec="" 1="" ×="" 10−6="" mol/l="" de="" rutine="" a="" également="" montré="" un="" effet="" protecteur,="" augmentant="" significativement="" la="" viabilité="" cellulaire="" à="" 63,78="" %="" par="" rapport="" au="" traitement="" par="" hypoxie.="" la="" viabilité="" prétraitée="" avec="" 1="" ×="" 10−5="" mol/l="" de="" norwogonine="" a="" été="" réduite="" à="" 63,43 %,="" ce="" qui="" est="" encore="" significativement="" supérieur="" à="" celui="" du="" groupe="" hypoxique="" (p="">< 0,05).="" ces="" résultats="" ont="" démontré="" que="" la="" norwogonine="" présentait="" une="" cytoprotection="" significative="" aux="" concentrations="" de="" 1="" ×="" 10−="" 8="" -1="" ×="" 10−="" 5="" mol/l="" et="" la="" concentration="" la="" plus="" efficace="" est="" de="" 1="" ×="" 10−="" 6="" mol/l.="" ensuite,="" cette="" dose="" a="" été="" utilisée="" comme="" dose="" optimale="" dans="" les="" expériences="">

La capacité protectrice de la norwogonine a également été vérifiée par des altérations morphologiques. Comme le montre la figure 2c, les cellules PC12 sans traitement par hypoxie ont bien poussé avec des formes régulières (fusiformes) et des tailles uniformes. Après exposition à l'hypoxie, les cellules PC12 présentaient un rétrécissement, une forme arrondie, une desquamation et une densité cellulaire réduite. Les cellules prétraitées avec de la norwogonine ou de la rutine avant l'exposition à l'hypoxie se sont améliorées, le nombre de cellules de desquamation a diminué et la forme des cellules s'est rétablie normalement. En outre, la capacité protectrice de la norwogonine a été confirmée par la fuite de LDH, qui est associée à la perte de l'intégrité de la membrane cellulaire. Comme le montre la figure 2d, l'activité LDH dans le milieu de culture a été considérablement augmentée après une exposition à l'hypoxie (P <>

Un prétraitement avec de la norwogonine ou de la rutine a considérablement réduit la fuite de LDH, suggérant que la norwogonine et la rutine ont restauré l'intégrité de la membrane cellulaire. La norwogonine inhibe le stress oxydant induit par l'hypoxie dans les cellules PC12 ROS et MDA sont deux indicateurs importants du stress oxydant cellulaire induit par l'hypoxie. Comme le montrent les figures 3a et b, une augmentation significative de la teneur en ROS et en MDA a été observée dans les cellules PC12 après une exposition à l'hypoxie. Le prétraitement à la norwogonine ou à la rutine a significativement inhibé la production de ROS et de MDA.

Les enzymes antioxydantes, telles que SOD, CAT et GPx, sont considérées comme le principal système de défense contre le stress oxydatif dans les cellules. Comme le montre la Fig. 3c-e, l'exposition à l'hypoxie a inhibé de manière significative les activités de SOD, CAT et GPx dans les cellules PC12. Le traitement avec la norwogonine ou la rutine a inversé ces changements et restauré les activités des enzymes antioxydantes. L'ensemble de ces résultats indique que la norwogonine protège les cellules PC12 contre le stress oxydatif induit par l'hypoxie.