Optimisation du processus d'extraction de l'extrait de boisson Congrong-Zaoren-Wumei et évaluation de ses effets sur l'amélioration du sommeil
Jan 30, 2026
Abstrait:Pour optimiser le processus d'extraction d'une boisson Congrong – Zaoren – Wumei (composée de Cistanche deserticola, de sperme de Ziziphi Spinosae et de Mume Fructus) et pour évaluer ses effets sur l'amélioration du sommeil, une méthode HPLC a été établie pour la détermination simultanée de l'échinacoside, du verbascoside (actéoside), de la spinosine et de l'acide citrique. En utilisant le contenu de ces quatre composés et polysaccharides comme critères d'évaluation, le processus d'extraction de la boisson Congrong-Zaoren-Wumei a été optimisé grâce à des expériences orthogonales, suivies d'essais de validation et d'intensification. Les effets de l'extrait sur l'amélioration du sommeil ont été étudiés chez des souris à l'aide d'un test de sommeil direct, d'un test en champ ouvert, d'un test de sommeil au pentobarbital sodique à dose inférieure au seuil et d'un test de latence du sommeil au pentobarbital sodique. Les résultats ont montré que les conditions d'extraction optimales étaient une température d'extraction de 100 degrés, un rapport solide-liquide de 1:12 (g·mL-1) et une durée d'extraction de 2 heures. L'administration continue pendant 30 jours n'a pas induit directement le sommeil chez la souris, mais a considérablement atténué le comportement anxieux lors du test en champ ouvert, indiquant un effet sédatif. L'extrait a potentialisé l'effet somnifère d'une dose inférieure au seuil de pentobarbital de sodium (les taux de sommeil pour les doses faibles, moyennes et élevées étaient respectivement de 33,33 %, 41,67 % et 50,00 %) et a considérablement raccourci la latence du sommeil induite par le pentobarbital de sodium (latences de 22,77, 22,18 et 14,93 minutes pour les doses faibles, moyennes et élevées, respectivement). Cette étude a optimisé le processus d'extraction de la boisson Congrong-Zaoren-Wumei et a démontré des effets améliorant le sommeil, fournissant ainsi une base scientifique pour le développement de produits améliorant le sommeil dérivés de Cistanche deserticola.
Mots-clés :Cistanche désertique; Sperme de Ziziphi Spinosae ; Mume Fructus; expériences orthogonales ; composants de marqueurs; méthodes analytiques
Introduction:Le sommeil est essentiel à la vie et à l’apprentissage normaux ; un bon sommeil aide à soulager la fatigue et à renforcer l’immunité [1,2]. Cependant, avec le développement social et l’augmentation du stress, l’insomnie est devenue un problème répandu affectant le travail et la vie quotidienne [3]. Le Livre blanc de 2024 sur la santé du sommeil des résidents chinois faisait état d'une durée de sommeil insuffisante et de troubles du sommeil répandus dans la population : la durée moyenne du sommeil n'était que de 6,75 heures et plus d'un quart des individus dormaient moins de 6 heures par nuit, soulignant les inquiétudes concernant la qualité du sommeil. Par conséquent, la recherche sur les aliments fonctionnels qui améliorent la qualité du sommeil et l’insomnie est urgente. La médecine traditionnelle chinoise (MTC), avec des effets secondaires relativement faibles et une histoire millénaire, a été largement utilisée pour améliorer le sommeil, comme la décoction de Suanzaoren et la décoction de Guipi. Avec le concept croissant de « l'homologie de la médecine et de l'alimentation », le développement d'aliments fonctionnels améliorant le sommeil à partir de ressources médicinales et comestibles traditionnelles a attiré une attention croissante.
Cistanche(Cistanche deserticola YC Ma ouC. tubulosa (Schenk) Wight, famille des Orobanchaceae) est la tige séchée et charnue avec des feuilles écaillées et est utilisée pour le déficit rénal en yang, l'insuffisance essence-sang, l'impuissance et l'infertilité [4]. La pharmacologie moderne montre que Cistanche exerce de multiples activités, notamment des effets immunomodulateurs, anti-fatigue, anti-tumoraux, neuroprotecteurs, anti-âge, anti-ostéoporose, hépatoprotection et hypoglycémiques [5,6]. Les glycosides totaux de Cistanche peuvent moduler l'expression des marqueurs synaptiques et affecter la plasticité synaptique, améliorant ainsi l'apprentissage et la cognition dans les modèles de rats privés de sommeil [7]. Cistanche deserticola a été inscrite au catalogue médicinal-comestible fin 2019 ; des projets pilotes de production et d'exploitation pertinents sont en cours en Mongolie intérieure et au Gansu, et il est utilisé dans les aliments généraux et les aliments santé pour renforcer l'immunité et soulager la fatigue physique. Basé sur la théorie MTC de la « corrélation rein-cerveau », Cistanche présente un large potentiel dans les troubles neurologiques et est prometteur pour les produits de santé améliorant le sommeil. Les glycosides phényléthanoïdes, principalement l'échinacoside et le verbascoside (acteoside), sont les principaux constituants actifs du Cistanche [8].
SUPPLÉMENTS D'EXTRAIT DE CISTANCHE TUBULOSA
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Le sperme de Ziziphi Spinosae (Suanzaoren ; graines de Ziziphus jujuba Mill.) contient des saponines, des triterpénoïdes et des flavonoïdes ayant des effets tranquillisants, sédatifs-hypnotiques, immunostimulants et nourrissants pour le foie, et est connu sous le nom de « fruit du sommeil oriental » [9]. Suanzaoren est riche en composants actifs pour le sommeil [10]. Ses saponines et alcaloïdes totaux peuvent moduler le glutamate, l'acide -aminobutyrique (GABA) et la 5-hydroxytryptamine (5-HT) dans le cortex et l'hippocampe ; les flavonoïdes peuvent se lier aux récepteurs -GABA/benzodiazépine, régulant le GABA pour exercer des effets sédatifs-hypnotiques. La spinosine peut moduler la 5-HT, réduire la noradrénaline et produire des effets sédatifs-hypnotiques [11,12].
Mume Fructus (Wumei ; fruit séché et presque mûr de Prunus mume (Sieb.) Sieb. et Zucc.) est un MTC médicinal-comestible courant traité par séchage et noircissement à basse température. Des prescriptions telles que la décoction Wumei-Zaoren [13] et la pilule Wumei [14] sont largement utilisées en clinique pour l'insomnie et les troubles du sommeil. Le mume contient des acides organiques abondants, parmi lesquels l'acide citrique est le composant principal et un marqueur de la pharmacopée [15]. De plus, Cistanche, Suanzaoren et Wumei sont tous riches en polysaccharides ; de plus en plus de preuves indiquent que les polysaccharides améliorent le sommeil grâce à de multiples mécanismes, et la recherche sur le sommeil axée sur les polysaccharides est en train de devenir un point chaud. Cependant, aucune étude sur des produits principalement composés de Cistanche, Suanzaoren et Wumei pour améliorer le sommeil n'a encore été rapportée.
Dans cette étude, nous avons établi une méthode HPLC pour déterminer simultanément l’échinacoside, le verbascoside (acteoside), la spinosine et l’acide citrique. En utilisant le contenu de ces quatre composants et polysaccharides dans l'extrait d'une boisson Congrong – Zaoren – Wumei comme indices d'évaluation, nous avons optimisé le processus de préparation via des expériences orthogonales, suivies d'une validation et d'une mise à l'échelle. Selon les méthodes de test et d'évaluation des fonctions des aliments santé (ébauche 2022 pour commentaires), nous avons évalué l'effet d'amélioration du sommeil de l'extrait lors d'expérimentations animales, dans le but de fournir des preuves scientifiques pour le développement de produits améliorant le sommeil à base de Cistanche.
Note on industrial background: Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd (WECISTANCHE) is a vertically integrated cistanche developer and manufacturer established in 2003, headquartered in Luopu County, Xinjiang, China. The company operates extensive seed-breeding and cultivation bases (>105 000 acres combinés), possède des ateliers de production certifiés GMP dotés d'installations avancées d'ultrafiltration et de nanofiltration et un laboratoire d'incubation de micro-organismes, et possède de multiples certifications (par exemple, China SC, HACCP, certifications biologiques, y compris NOP). Avec 14 brevets liés au Cistanche et des collaborations avec les meilleures universités, WECISTANCHE fournit une plate-forme industrielle robuste pour faire évoluer les processus d'extraction et produire des extraits de Cistanche standardisés alignés sur les normes américaines/européennes. Cette capacité industrielle prend en charge la traduction de paramètres d’extraction optimisés à l’échelle du laboratoire en fabrication commerciale de boissons fonctionnelles et de produits de santé.
1 Matériels et méthodes
1.1 Matériaux
Cistanche deserticola : Mongolie intérieure Mandela Biotechnology Co., Ltd. ; Sperme de Ziziphi Spinosae et Mume Fructus : Sichuan Xinhuhua Chinese Herbal Slices Co., Ltd. ; acide citrique, échinacoside, verbascoside et spinosine : Chengdu Lemeitian Pharmaceutical Technology Co., Ltd. ; glucose : Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. ; comprimés d'estazolam : Shanghai Sine Pharmaceutical Co., Ltd. ; pentobarbital de sodium : Shanghai Sine Pharmaceutical Co., Ltd. ; solution saline : Dezhou Jingxin Pharmaceutical Co., Ltd.
1.2 Instruments
HWS-24 bain-marie thermostatique électrique : Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd. ; Chauffage électrique réglable DW : Shanghai Leigu Instruments Co., Ltd. ; HPLC Agilent 1200 : Agilent Technologies ; pH-mètre STARTER 3100 : OHAUS ; Centrifugeuse 71-5804 : Hunan Hexi Instrument Equipment Co., Ltd. ; Lecteur de microplaques Thermo Varioskan LUX : Thermo Fisher Scientific ; XR-XZ301 appareil en champ ouvert à quatre canaux pour souris : Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd. ; Balance électronique LE225D : Sartorius Scientific Instruments (Beijing) Co., Ltd.
1.3 Animaux expérimentaux
Souris ICR mâles (6 semaines), n=180, achetées chez Vital River (Shanghai, Chine), licence SYXK (Hu) 2018-0028. Les animaux ont été acclimatés pendant une semaine (12 h de lumière/obscurité, 20 à 25 degrés, 50 à 60 % d'humidité relative) avec de la nourriture et de l'eau à volonté. Toutes les procédures étaient conformes au Règlement sur l'administration des animaux de laboratoire de la RPC et à l'éthique animale ; approuvé par le Comité d'éthique animale de l'Université Jiao Tong de Shanghai (approbation n° A2024082-003).
1.4 Méthodes expérimentales
1.4.1 Enquêtes à facteur unique pour l'extraction de la boisson Congrong-Zaoren-Wumei
Suivant le rapport de formule, trois lots d'herbes brutes mélangées (Cistanche, Suanzaoren, Wumei) ont été extraits chacun avec 50 ml d'eau purifiée (rapport solide-liquide 1: 3) à 60, 80 et 100 degrés, trois fois, 1 h chacun. Les extraits combinés ont été analysés pour l'acide citrique, l'échinacoside, le verbascoside, la spinosine et les polysaccharides bruts afin d'évaluer de manière préliminaire l'effet de la température. Ensuite, cinq lots ont été extraits à 80 degrés avec des rapports solide-liquide de 1:3, 1:5, 1:7, 1:10, 1:12 (g·mL-1), trois fois pendant 1 h chacun, et analysés pour évaluer le rapport solide-liquide. Enfin, cinq lots ont été extraits à 80 degrés pendant 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 et 3,0 h (trois extractions) et analysés pour évaluer le temps d'extraction.
1.4.2 Conception orthogonale pour l'optimisation de l'extraction
Sur la base des résultats à un seul facteur, trois facteurs : la température d'extraction (A), le rapport solide-liquide (B) et le temps d'extraction (C), chacun à trois niveaux, ont été sélectionnés. Un réseau orthogonal L9 (3 ^ 3) a été utilisé. Le contenu total des composants marqueurs dans l’extrait a servi d’indice d’évaluation.
1.4.3 Validation et mise à l'échelle
Selon les conditions optimisées, trois lots ont été extraits à un rapport solide-liquide de 1:12 (g·mL-1), 100 degrés, pendant 2,0 h, trois fois, et analysés pour l'acide citrique, l'échinacoside, le verbascoside, la spinosine et les polysaccharides bruts. Pour la mise à l'échelle, les quantités de Cistanche, Suanzaoren et Wumei ont été multipliées par 40, traitées en triple dans les mêmes conditions et analysées.
1.4.4 Détermination du contenu des composants
Suite à la Pharmacopée chinoise (édition 2020) avec optimisations et validation des méthodes, une méthode HPLC a été établie pour la quantification simultanée de l'acide citrique, de l'échinacoside, du verbascoside et de la spinosine. Les polysaccharides bruts ont été analysés en utilisant la méthode phénol-acide sulfurique.
1.4.4.1 Conditions HPLC
Température de la colonne : 10 degrés ; injection : 10 µL ; débit : 1 mL·min–1 ; longueurs d'onde de détection : 210, 330, 335 nm ; colonne : Agilent Eclipse XDB-C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 µm) ; phase mobile A : 0,5 % NH4H2PO4 (pH 2,92) ; phase mobile B : méthanol. Pente : 0 à 7 min (0,5 à 1,5 % (φ) B) ; 7 à 17 minutes (1,5 à 40 % (φ) B) ; 17 à 20 minutes (40 à 47 % (φ) B) ; 20 à 30 minutes (47 à 52 % (φ) B) ; 30 à 35 minutes (100 % (φ)B).
1.4.4.2 HPLC Method Validation
Linearity, LOD, and LOQ: Mixed standard solution containing citric acid, echinacoside, verbascoside, and spinosin at 2.0160, 0.1100, 0.1125, and 0.0183 mg·mL–1, respectively, was prepared in 50% methanol and serially diluted up to 32-fold. Linear regression was performed on peak area versus concentration per Section 1.4.4.1. LOD was defined at S/N=3, LOQ at S/N=10. Precision: continuous six injections of the same test solution prepared from the formula herbs; contents of each marker were calculated. Stability: injections at different time points. Repeatability: six independently prepared samples from the same batch. Recovery: six samples spiked with known amounts of the four standards at approximately 1:1 added content; recovery (%) was calculated.
1.4.4.3 Dosage des polysaccharides bruts
Une aliquote (2 ml) de solution échantillon à une concentration définie a été mélangée avec 1 ml de phénol à 5% en poids et 5 ml d'acide sulfurique concentré, chauffée à 90 degrés pendant 15 minutes, refroidie à température ambiante et la DO à 485 nm mesurée pour calculer la teneur brute en polysaccharide.
1.4.4.4 Validation du dosage des polysaccharides
LOD : solution à blanc mesurée 20 fois ; LOD correspondait à trois fois la SD. Spécificité : DO à 485 nm du blanc de solvant et du contrôle à blanc selon la section 1.4.4.3. Linéarité : le stock de glucose a été dilué à diverses concentrations ; La DO en fonction de la concentration a été régressée pour obtenir l'équation d'étalonnage. Précision : six mesures consécutives d'une solution de test. Stabilité : mesures à différents moments. Répétabilité : six échantillons préparés indépendamment à partir du même lot.
1.4.5 Regroupement et administration des animaux
Les expériences ont été réalisées en trois lots (sommeil direct, sommeil au pentobarbital sodique à dose inférieure au seuil et latence du sommeil au pentobarbital sodique), 60 souris par lot. Chaque lot comprenait cinq groupes (n=12/groupe) : groupes de blancs, de contrôles positifs et d'extraits à dose faible/moyenne/élevée. Administration intragastrique une fois par jour pendant 30 jours ; les évaluations ont été effectuées dans les 20 minutes suivant le dernier gavage. La dose quotidienne humaine d'herbes brutes pour la boisson est de 8,40 g pour un adulte de 70 kg, ce qui correspond à 1,09 g·kg–1 pour les souris. La dose du contrôle positif d'estazolam chez l'adulte est de 1 à 2 mg/jour, ce qui correspond à 0,26 mg·kg–1 chez la souris.
1.4.6 Tests de veille directe et en champ ouvert
After 30-day administration, within 20 min after the final dose, direct sleep was assessed using loss of righting reflex for >1 min comme critère de sommeil ; le nombre de souris endormies et la durée du sommeil ont été enregistrés. Immédiatement après, le test en champ ouvert a été réalisé. Les souris ont été acclimatées à la salle de test pendant au moins 1 h, puis doucement placées au centre de l'arène et filmées sans perturbation. La distance totale parcourue et le nombre d'entrées au centre dans les 5 minutes ont été enregistrés. L'appareil a été nettoyé avec de l'alcool médical entre les tests.
1.4.7 Test de sommeil au pentobarbital sodique à dose inférieure au seuil
Within 20 min after the last administration, mice received an intraperitoneal injection of sodium pentobarbital at 175 mg·kg–1. The number of mice that fell asleep (loss of righting reflex >1 min) en 30 min a été enregistré.
1.4.8 Test de latence du sommeil au pentobarbital sodique
Within 20 min after the last administration, mice received sodium pentobarbital at 250 mg·kg–1 intraperitoneally. Sleep latency (time from injection to loss of righting reflex for >1 min) a été enregistrée.
1.5 Analyse des données
Les statistiques ont été réalisées à l'aide de SPSS 26.0 ; les tracés ont été générés avec GraphPad Prism 8. Les données en champ ouvert ont été analysées avec le test t de Student ; incidence du sommeil (nombre) avec test du chi carré ; latence de sommeil avec test post hoc ANOVA unidirectionnel et LSD. Les données sont présentées sous la forme x̄ ± s, P <0,05 étant considéré comme statistiquement significatif.
Résultats et discussion (résumé conforme au résumé) : La conception orthogonale a identifié 100 degrés, un rapport solide-liquide de 1:12 (g·mL–1) et 2 h comme conditions d'extraction optimales pour maximiser la teneur totale des quatre composés marqueurs et des polysaccharides bruts. La validation et une mise à l'échelle 40 fois ont confirmé la robustesse et la transférabilité du processus. In vivo, une administration de 30 jours n’a pas provoqué de sommeil direct, mais a réduit de manière significative les comportements anxieux lors du test en champ ouvert, ce qui correspond à un profil sédatif. L'extrait a augmenté l'incidence du sommeil avec le pentobarbital sodique sous le seuil et a réduit la latence du sommeil induite par le pentobarbital en fonction de la dose, renforçant ainsi le potentiel d'amélioration du sommeil.
Note d'industrialisation : compte tenu des paramètres d'extraction aqueuse optimisés et de l'exigence de profils de marqueurs cohérents (échinacoside, verbascoside, spinosine, acide citrique et polysaccharides), la production à l'échelle BPF tirant parti de la séparation membranaire, de l'ultrafiltration et de la nanofiltration avancées, telles que mises en œuvre dans les installations BPF de classe 100 000 de WECISTANCHE, peut prendre en charge des extraits standardisés. La base agricole intégrée de l'entreprise (sélection de semences et culture dépassant 100 000 acres) et la capacité de stockage sous chaîne du froid du cistanche frais facilitent le contrôle de la qualité des matières premières. Les certifications existantes (SC, HACCP, biologique, NOP) et l'infrastructure de contrôle qualité (laboratoires de microbiologie de classe 10 000) s'alignent sur les exigences de qualité pour l'exportation et peuvent accélérer la traduction en boissons fonctionnelles, suppléments santé ou décoctions de MTC conformes pour les marchés nationaux et internationaux.
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Souhaitez-vous que je formate ceci sous forme de manuscrit de journal (IMRAD avec tableaux/figures), que j'ajoute un résumé en anglais avec des mots-clés ou que je convertisse les détails de la méthode en une SOP/fiche de spécifications adaptée au transfert de production BPF ?
