Partie 1 : Établissement du modèle expérimental simultané d'ostéoporose associée à la maladie d'Alzheimer chez le rat et des effets doubles de l'échinacoside et de l'actéoside de Cistanche Tubulosa
Mar 24, 2022
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Yi Chen, Ying-Qi Li, Jia-Yi Fang, Ping Li, Fei Li
ABSTRAIT
Pertinence ethnopharmacologique : Cistanche tubulosaest une précieuse médecine traditionnelle chinoise qui a été largement utilisée dans le traitement de l'ostéoporose etLa maladie d'Alzheimer. Échinacosideet l'actéoside sont les principaux constituants actifs de Cistanche tubulosa qui ont des activités pharmacologiques à valeur de recherche. Il a été rapporté que l'échinacoside etactéosidepourrait améliorer les capacités d'apprentissage et de mémoire, favoriser la prolifération et la différenciation des ostéoblastes. Objectif de l'étude : Echinacoside et actéoside deCistanche tubulosaont montré des activités significatives d'anti-ostéoporose et d'anti-maladie d'Alzheimer, alors que ces effets n'ont pas été étudiés simultanément dans un modèle de rat. Le but de cette étude était d'établir et de vérifier le modèle de l'ostéoporose associée àLa maladie d'Alzheimerchez le rat et d'étudier les doubles effets deéchinacosideet actéoside sur ce modèle concurrent.
Matériaux et méthodes:Trois groupes de modèles d'ovariectomie (OVX), de chirurgie factice avec D-galactose et AlCl3 (D), d'ovariectomie avec D-galactose et AlCl3 (OVX plus D) ont été définis en même temps. Les rats des groupes de traitement médicamenteux ont été ovariectomisés. Lors de l'injection intrapéritonéale de D-galactose et de l'administration intragastrique d'AlCl3 chez les rats des groupes de traitement médicamenteux, les rats ont reçu par voie oraleéchinacoside(90 mg/kg/j),actéoside(90 mg/kg/j) et les médicaments témoins positifs de valérate d'estradiol (0,6 mg/kg/j), le chlorhydrate de donépézil (0,8 mg/kg/j), respectivement. Après le traitement médicamenteux de 8 semaines, le test Morris Water Maze (MWM) pendant 6 jours a été réalisé pour la première fois. Les rats ont ensuite été sacrifiés pour récolter le sang, les utérus, les fémurs, les tibias et les tissus cérébraux. Le sérum a été utilisé pour des tests biochimiques. Les utérus ont été utilisés pour l'histomorphométrie. Les fémurs droits ont été utilisés pour Micro-TDMet histomorphométrie, respectivement. Les tibias droits ont été utilisés pour le test biomécanique. L'hippocampe recueilli sur la glacière a été utilisé pour des tests biochimiques. Le cerveau 41 prélevé par perfusion a été utilisé pour l'histomorphométrie.
Résultats:Comparé au groupe Sham, le groupe OVX plus D pourrait réduire considérablement la capacité d'apprentissage et de mémoire en provoquant des dommages oxydatifs, en altérant les neurones de l'hippocampe et en affectant l'hydrolyse et la synthèse de l'acétylcholine. Pendant ce temps, les activités de BALP et TRAP dans le groupe OVX plus D ont augmenté de manière significative (P<0.001) as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" in="" addition,="" compared="" with="" the="" sham="" group,="" the="" mean="" bone="" mineral="" density="" obviously="" decreased=""><0.05), the="" trabecular="" bone="" mass="" and="" microarchitecture="" were="" also="" destroyed="" significantly="" in="" the="" ovx+d="" group.="" furthermore,="" the="" maximum="" load="" and="" maximum="" stress="" significantly="" reduced=""><0.01) and="" the="" energy="" 50="" absorption="" also="" decreased="" greatly="" as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" after="" being="" administrated="" with="">échinacosideetactéoside, les caractéristiques pathologiques typiques de l'ostéoporose etLa maladie d'Alzheimeront été améliorés.
Conclusion :Le modèle de l'ostéoporose associé àLa maladie d'Alzheimerchez le rat était faisable et établie avec succès.Échinacosideet l'actéoside ont également montré des effets significatifs sur ce modèle simultané, et ils pourraient être des candidats potentiels de 56Cistanche tubulosaà double effet pour complément d'étude.
Mots clés:l'ostéoporose; La maladie d'Alzheimer; double effets; échinacoside; l'actéoside; Cistanche tubulosa
CLes herbes de l'empire perdu d'istanche améliorent la maladie d'Alzheimer
1. Introduction
L'ostéoporose est une maladie osseuse dégénérative caractérisée par une perte progressive de la masse osseuse et une destruction de la microarchitecture, ce qui peut augmenter le risque de fracture de fragilité (Rachner et al., 2011).La maladie d'Alzheimer(AD) est une maladie neurodégénérative courante chez les personnes âgées qui se caractérise par un déclin mental continu, des troubles cognitifs et une perte de capacité de vie indépendante en clinique (Reitz 76 et al., 2011). La formation de plaque sénile induite par le dépôt d'amyloïde, les enchevêtrements neurofibrillaires causés par l'hyperphosphorylation de tau et la dégénérescence neuronale dans le cerveau sont les caractéristiques pathologiques typiques de la MA (Serrano-Pozo et al., 2011). Superficiellement, l'OP et la MA sont des maladies complètement indépendantes avec des pathologies et des caractéristiques cliniques différentes. Cependant, on observe souvent que l'OP et la MA coexistent dans la pratique clinique (Zhang et al., 2001 ; Lui et al., 2003 ; Luckhaus et al., 2009). La prévalence des deux maladies augmentait avec l'âge, en particulier chez les femmes ménopausées (Li et al., 2017 ; Stern, 2012). De plus en plus de preuves indiquent que les personnes diagnostiquées avec la MA ont un risque accru de PO (Zhou et al., 2014).
Il est nécessaire d'étudier et de clarifier les relations entre l'ostéoporose etLa maladie d'Alzheimerin vitro et in vivo. Avant que les études ne soient réalisées in vivo, il est important de sélectionner les modèles animaux applicables de l'ostéoporose ou de la maladie d'Alzheimer. Le modèle d'ostéoporose pourrait être établi par plusieurs types de méthodes telles que l'administration intragastrique d'acide rétinoïque, la chirurgie de l'ovariectomie et l'injection intramusculaire de glucocorticoïdes (Wei et al., 2007 ; Komori, 2015). En particulier, le modèle d'ostéoporose post-ménopausique induite par ovariectomie chez le rat était classique eta été largement utilisé dans la plupart des études (Miao et al., 2012 ; Liu et al., 2017).La maladie d'Alzheimer sporadique est le principal type de maladie d'Alzheimer. L'animalmodèles de SporadicLa maladie d'Alzheimerpourrait être induite par diverses méthodes telles queinjection de D-galactose ou -amyloïde, administration intragastrique d'AlCl3,etc(Bagheri et al., 2011 ; Gao et al., 2015 ; Justin Thenmozhi et al., 2017). De plus, lemodèle de conjonction de la maladie d'Alzheimer induite par voie intrapéritonéale à long termel'injection de D-galactose associée à l'ovariectomie a également été beaucoup étudiée (Liuet al., 2010 ; Zhao et al., 2012). Afin de révéler la pertinence de l'ostéoporose etmaladie d'Alzheimer, il faut établir le modèle de l'ostéoporose combinéeatteints de la maladie d'Alzheimer pour étudier les mécanismes communs des médicaments surl'ostéoporose etla maladie d'Alzheimerase.
Cistanche tubulosa(Schenk) Wight est une plante parasite, qui est principalement distribuée dans les déserts du nord-ouest de la Chine. Les tiges succulentes séchées deCistanche tubulosa(CT) sont utilisés comme un médicament tonique célèbre appelé Cistanches Herba avec son nom chinois de Roucongrong dans la pharmacopée chinoise (2015). Il a été honoré comme "ginseng des déserts" et est largement utilisé pour le traitement des douleurs à la taille et aux genoux, la stérilité féminine et la constipation dans la médecine traditionnelle chinoise (Jiang et Tu, 2009). Les principaux constituants actifs du CT sont les glycosides phényléthanoïdes (PhG), l'échinacoside (ECH) etactéoside(ACT) sont les composés représentatifs des PhG (Morikawa et al., 2014). En particulier, ECH et ACT sont généralement sélectionnés comme marqueurs pour le contrôle de la qualité en CT en raison de leur contenu élevé et de diverses activités pharmacologiques telles que les effets de la neuroprotection, de la protection osseuse,
antioxydants, anti-âge et améliorant la capacité d'apprentissage et de mémoire (Wang et al.,2012 ; Li et al., 2016). Cependant, les effets de l'ECH et de l'ACT sur l'ostéoporosecombiné avecLa maladie d'Alzheimern'avaient pas encore été étudiés ensemble dans un modèle de rat.Ainsi, le but de cette étude était d'établir un modèle rat d'ostéoporose combinéatteints de la maladie d'Alzheimer et explorez les effets deéchinacosideet l'actéoside sur cemodèle concurrent, afin de fournir des preuves expérimentales pour une étude plus approfondie de lamécanisme moléculaire de l'échinacoside ou de l'actéoside dans les recherches suivantes.
spécial cistanche pharmapourUN D
2. Matériels et méthodes
2.1. Animaux
Quatre-vingt 8-rats femelles Wistar âgées d'une semaine (numéro de certificat : SCXK 2018-0006), pesant entre 180 et 200 g, ont été acquises auprès du Sino-British SIPPR/BK Lab. Animal Ltd (Shanghai, Chine) et a grandi au Centre expérimental des animaux pharmaceutiques de l'Université pharmaceutique de Chine.
2.2. produits chimiques et réactifs
L'hydrate de chloral, la pénicilline G sodique, le D-galactose, le chlorure d'aluminium hexahydraté, le valérate d'estradiol, le chlorhydrate de donépézil ont été achetés auprès d'Aladdin Industrial Corporation (Shanghai, Chine).Échinacoside(HPLC 94 pour cent) a été obtenu auprès de Chengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Chine).Actéoside(HPLC 98 pour cent) a été acheté auprès de Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Chine). Des kits de phosphatase alcaline osseuse spécifique (BALP), de phosphatase acide tartrate-résistante (TRAP), de superoxyde dismutase (SOD), de malonaldéhyde (MDA), d'acétylcholinestérase (AChE) et de dosage immunoenzymatique (ELISA) de la choline acétyltransférase (ChAT) ont été acheté auprès de Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, Chine). Le fixateur tissulaire universel a été obtenu à partir deChengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Chine).
échinacoside
2.3. Modèles animaux et traitements
Toutes les expérimentations animales ont été autorisées et supervisées par le Comité d'éthique animale de l'Université pharmaceutique de Chine. Les rats ont été maintenus avec un cycle lumière / obscurité de 12 h dans une pièce à température contrôlée (22 ± 2 degrés) et nourris avec du fourrage granulé standard et de l'eau du robinet.
Après l'adaptation d'une semaine, le modèle d'ostéoporose a été atteint en réalisant une chirurgie d'ovariectomie (French et al., 2008). Une fois l'opération terminée, la pénicilline G sodique a été saupoudrée sur la suture de la plaie pendant une fois pour prévenir l'infection. Les rats ont ensuite été nourris normalement pendant trois semaines. Selon la référence (Hua et al., 2007 ; Alawdi et al., 2017), le modèle deLa maladie d'Alzheimerpourrait être induite par une injection intrapéritonéale à long terme de D-galactose associée à une ovariectomie ou à une administration intragastrique à long terme d'AlCl3. Pour étudier la faisabilité du modèle d'ostéoporose associée à la maladie d'Alzheimer, trois groupes modèles d'ovariectomie (groupe OVX), de chirurgie fictive avec injection intrapéritonéale de 150 mg/kg/j de D-galactose et administration intragastrique de 30 mg/kg/j d'AlCl3 (groupe D), une ovariectomie avec injection intrapéritonéale de 150 mg/kg/j de D-galactose et administration intragastrique de 30 mg/kg/j d'AlCl3 (OVX plus groupe D) ont été mises en place dans cette étude.
Par conséquent, les rats ont été divisés au hasard en huit groupes (n{{0}} pour chaque groupe) après 3 semaines et traités par voie orale avec des médicaments pendant 8 semaines : groupe Sham ; groupe OVX ; groupe D ; OVX plus groupe D ; groupe de traitement au valérate d'estradiol (groupe EV, OVX plus D plus 0.6 mg/kg/j de valérate d'estradiol) ; groupe de traitement par chlorhydrate de donépézil (groupe DPZ, OVX plus D plus 0,8 mg/kg/j de chlorhydrate de donépézil );échinacosidegroupe de traitement (groupe ECH, OVX plus D plus 90 mg/kg/j d'échinacoside) ;actéosidegroupe de traitement (groupe ACT, OVX plus D plus 90 mg/kg/j d'actéoside). Selon le principe de conversion de dose équivalente humain-rat et la dose de référence connexe (Li et al., 2013 ; Gao et al., 2014), les dosages des groupes de traitement médicamenteux de cette étude ont été adoptés.
Le poids corporel de chaque rat a été mesuré chaque semaine. Après l'ensemble du traitement avec des médicaments d'une durée de 8 semaines, le test Morris Water Maze (MWM) pendant 6 jours a été effectué pour la première fois. Après cela, 6 rats de chaque groupe ont été sacrifiés pour récolter les matériaux. Les rats ont été anesthésiés avec une injection intrapéritonéale de 3,0 mL/kg d'hydrate de chloral à 10 %, et du sang a été prélevé des abdominaux de l'aorte. Le sang a été placé à température ambiante pour coaguler et centrifugé à 3500 tr/min pendant 10 min. Le sérum a été récolté dans un tube à centrifuger de 1,5 ml (NEST Biotechnology) et stocké à -80 degré jusqu'à son utilisation pour des tests biochimiques. Les utérus, les fémurs, les tibias et les tissus cérébraux ont ensuite été prélevés. Les utérus ont été utilisés pour l'histomorphométrie. Les fémurs droits ont été utilisés pour la micro-CT et l'histomorphométrie, respectivement. Les tibias droits ont été utilisés pour le test biomécanique. L'hippocampe recueilli sur la glacière a été utilisé pour des tests biochimiques. Après cela, les trois autres rats de chaque groupe ont été perfusés par le cœur avec une solution saline et un fixateur tissulaire universel pour récolter le cerveau pour l'histomorphométrie.
2.4. Test du labyrinthe aquatique de Morris (MWM)
Les rats ont été soumis à des tests d'apprentissage et de mémoire de référence spatiale dans le test MWM après 8 semaines d'intervention. Le test MWM a été réalisé selon les méthodes rapportées précédemment (Morris, 1984 ; Gao et al., 2016). En bref, 5 jours consécutifs avec quatre essais par jour, les rats ont été entraînés à utiliser une variété de repères visuels situés sur la paroi de la piscine pour trouver une plate-forme immergée cachée (diamètre 11 cm, hauteur 29 cm) dans une piscine circulaire (diamètre 130 cm, hauteur 50 cm) remplie d'eau teintée à l'encre de carbone non toxique. La piscine était imaginairement divisée en quatre quadrants et quatre positions de départ étaient situées aux intersections des quadrants. La plate-forme était située au centre d'un des quadrants et la position était constante pendant les essais. Dans chaque essai, les rats ont été placés au hasard dans des endroits sélectionnés, face au mur de la piscine. Chaque essai a été terminé lorsque le rat a atteint la plate-forme ou après 60 s, et le temps écoulé a été enregistré comme latence d'échappement. Les rats qui n'atteignaient pas la plate-forme étaient guidés vers celle-ci. Après chaque essai de plateforme cachée, le rat est resté sur la plateforme pendant 10 s. Le temps de latence moyen de quatre essais par jour a été calculé en tant que résultats d'entraînement. Au jour 6, tous les rats ont été soumis à un essai de sonde dans lequel ils ont nagé pendant 60 s dans la piscine sans plate-forme. Les temps de traversée à l'emplacement de la plate-forme et le temps de déplacement dans le quadrant cible ont été enregistrés comme résultats finaux. Les rats ont été surveillés par une caméra montée au plafond directement au-dessus de la piscine, et tous les essais ont été enregistrés et analysés à l'aide du programme MORRIS MAZE fourni par Beijing zhongshidichuang science and technology development Co., Ltd. (Pékin, Chine)
2.5. Test biochimique par ELISA
Selon les instructions du fabricant des kits ELISA, l'activité de la phosphatase alcaline spécifique à l'os (BALP), l'activité de la phosphatase acide tartrate-résistante (TRAP), l'activité de la superoxyde dismutase (SOD) et la teneur en malondialdéhyde (MDA) dans le sérum ont été testées par BioTek Synergy 2 lecteurs de microplaques multimodes (BioTek, USA). Les tissus de l'hippocampe de chaque groupe ont été lavés avec du PBS (0.01 M, pH 7,4) pour éliminer le sang ou les impuretés restant à la surface des tissus. Les tissus de l'hippocampe d'un côté ont été pesés puis coupés en morceaux aussi petits que possible. Les tissus d'hippocampe ont été homogénéisés selon le rapport de 1 : 9 (poids des tissus : volume de PBS). L'homogénat a été centrifugé à 4 degrés, 3000 tr/min pendant 15 min. Le surnageant a été recueilli et dilué pour mesurer la concentration en protéines par la méthode BCA. L'activité de l'acétylcholinestérase (AChE), l'activité de la choline acétyltransférase (ChAT), l'activité de la superoxyde dismutase (SOD) et la teneur en malondialdéhyde (MDA) dans le tissu de l'hippocampe ont ensuite été testées par des méthodes ELISA.
2.6. Histomorphométrie de l'hippocampe
Les tissus cérébraux (n=3/groupe) ont été fixés dans un fixateur tissulaire universel. Les échantillons de tissus cérébraux ont ensuite été lavés, déshydratés avec un gradient d'éthanol, inclus dans de la cire de paraffine et découpés en coupes coronales de 5 μm. Les coupes ont été colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine (HE). Après cela, les coupes coronales des tissus cérébraux ont été photographiées par un microscope à fluorescence inversé (Nikon, Japon). Les changements morphologiques de CA1, CA2, CA3 et DG dans l'hippocampe ont été particulièrement observés.
2.7. Histomorphométrie et morphométrie utérines
Les utérus sélectionnés (n{{0}}/groupe) ont été fixés dans un fixateur tissulaire universel. Les échantillons de tissu utérin ont ensuite été lavés, déshydratés avec un gradient d'éthanol, inclus dans de la cire de paraffine et découpés en sections transversales de 5 μm. Les coupes ont été colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine (HE). Les sections transversales de l'utérus ont été observées et photographiées. Cinq champs de vision ont été choisis au hasard, le diamètre de la coupe transversale utérine et l'épaisseur épithéliale de la muqueuse utérine ont ensuite été mesurés à l'aide du logiciel Image-Pro Plus 6.0. Le nombre de glandes utérines dans la lamina propria a également été compté.
2.8. Micro-CT
Les fémurs droits sélectionnés (n=3/groupe) ont été scannés dans une position avec la distance de l'objet à la source de 121 mm et la distance de la caméra à la source de 171 mm à l'aide d'un SkyScan 1176 micro X- tomodensitométrie (Micro-TDM) scanner (Bruker, Allemagne). La plaque de croissance distale a été choisie comme surface de référence. Avec une distance de 1 mm sous la surface de référence, une région de 1,8 mm d'épaisseur a été sélectionnée comme volume d'intérêt (VOI, 100 couches). Les images en niveaux de gris résultantes avaient une taille de pixel de 17,76 μm à partir de la reconstruction osseuse (65 kV, 385 μA). Une méthode de contourage semi-automatisée a été utilisée pour sélectionner les trabécules de l'os cortical. Des méthodes de mesure 3D directes ont été utilisées pour évaluer le pourcentage de volume osseux (BV/TV), la densité de surface osseuse (BS/TV), la séparation trabéculaire (Tb. Sp), le nombre trabéculaire (Tb. N), l'épaisseur trabéculaire (Tb. Th) , indice de modèle de structure (SMI), facteur de motif trabéculaire (Tb. Pd) et densité minérale osseuse moyenne (DMO moyenne) pour le même VOI en utilisant leTDMProgramme d'analyseur (Bruker, Allemagne). La visualisation 3D du VOI à l'aide d'un algorithme de rendu adaptatif a été réalisée avec le logiciel CTvol (Bruker, Allemagne).
extrait de plante cistanche
2.9. Histomorphométrie osseuse
Les fémurs droits sélectionnés (n=3/groupe) ont été fixés dans un fixateur tissulaire universel, puis décalcifiés dans une solution à 10 % d'EDTA-2Na pendant 3 semaines. Les échantillons décalcifiés ont été lavés, déshydratés avec un gradient d'éthanol, inclus dans de la cire de paraffine et découpés en sections longitudinales de 5 μm. Les coupes ont été colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine (HE). Les coupes longitudinales des fémurs ont été photographiées. Les structures du tissu osseux de chaque groupe, en particulier les structures osseuses trabéculaires, ont été observées.
2.10. Test biomécanique
Les tibias droits (n=4/groupe) sélectionnés au hasard ont été évalués pour le test de flexion en trois points à l'aide d'une machine de test universelle (SHIMADZU, Japon). Les diamètres de ces échantillons ont été mesurés au pied à coulisse dans la plage de 2,16-2,38 mm (d). L'échantillon a ensuite été placé sur deux traverses de support avec une distance de 25 mm (L) entre les deux rails et la courbure physiologique de l'échantillon était vers le haut. La tige de chargement de la charge était située au centre de l'éprouvette et tombait à une vitesse constante de 1,5 mm/min jusqu'à ce que l'éprouvette soit brisée. Les données de force (F) et de déplacement ont été automatiquement enregistrées dans un ordinateur qui a été interfacé avec la machine d'essai et la courbe charge-déformation a été tracée simultanément. Les valeurs de charge maximale (N) et d'absorption d'énergie (mJ) ont été enregistrées par le logiciel d'essai de matériaux TRAPEZIUM X en même temps. Les valeurs de contrainte maximale (MPa) ont été calculées selon la formule suivante : Contrainte (σ)=Moment de flexion (M) / Facteur de section (Z)=(8×L×F) / ( π×d3 )
2.11. analyses statistiques
Les résultats des groupes modèles ont été comparés avec le groupe Sham, et ceux des groupes traités avec le médicament ont été comparés avec le groupe OVX plus D. Les données ont été analysées à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple de Bonferroni à l'aide du logiciel Graph Pad Prism 5.0. Les données ont été exprimées en moyenne ± SD, et les valeurs P inférieures à 0.05 ont été considérées comme statistiquement significatives.
myricétineetcistanche
