Partie 1 Effets préventifs des glycosides de phényléthanol de Cistanche Tubulosa sur la fibrose hépatique induite par l'albumine sérique bovine chez le rat

Contact : Audrey Hu Whatsapp/hp : 0086 13880143964 E-mail :audrey.hu@wecistanche.com

Résumé

Arrière plan:Cistanche tubulosa est une phytothérapie traditionnelle chinoise largement utilisée pour réguler l'immunité.Glycosides de phényléthanol de cistanche(CPhG) de cette plante sont les principaux matériaux efficaces. Le but de cette étude était d'évaluer les effets préventifs et thérapeutiques des CPhG sur la fibrose hépatique induite par la BSA chez le rat et les mécanismes moléculaires associés impliquant les cellules étoilées hépatiques. Le Biejiarangan (BJRG), une autre plante médicinale traditionnelle chinoise, a été utilisé comme témoin positif. Méthodes : dans des expériences in vivo, 75 rats SD ont été divisés au hasard en 6 groupes : normal (traité à l'eau distillée), modèle (traité à la BSA), médicament positif (traité à la BSA plus BJRG 60{{29} } mg/kg/jour) et les groupes traités par BSA plus CPhG (125, 250 et 500 mg/kg/jour). Les indices hépatique et splénique, les taux sériques d'aspartate aminotransférase (AST), d'alanine aminotransférase (ALT), d'acide hexadécénoïque (HA), de laminine (LN), de procollagène de type III (PCIII), de collagène de type IV (IV-C), d'hydroxyproline ( Hyp) et le facteur de croissance transformant 1 (TGF- 1) ont été mesurés dans le foie des rats. Les grades histopathologiques de la fibrose hépatique ont été évalués pour chaque groupe à l'aide de la coloration H&E et du trichrome de Masson. L'expression du TGF- 1, du collagène I (Col-I) et du collagène III (Col-III) a été déterminée par une méthode de coloration immunohistochimique. Ces effets ont ensuite été évalués in vitro en déterminant les niveaux d'expression de NF-κB p65 et Col-I par des analyses PCR quantitatives en temps réel. L'expression de la protéine Col-I a également été examinée par western blot. Résultats : Tous les groupes de doses (125, 250 et 500 mg/kg/jour) de CPhG ont réduit de manière significative l'indice hépatique et splénique, ont diminué les taux sériques d'ALT, d'AST, d'HA, de LN, de PCIII, d'IV-C, Contenu TGF- 1 (P < 0,01,="" p="">< 0,01="" et="" p="">< 0,01)="" et="" contenu="" hyp.="" les="" cphg="" ont="" également="" nettement="" atténué="" le="" gonflement="" des="" cellules="" hépatiques="" et="" prévenu="" efficacement="" la="" nécrose="" des="" hépatocytes="" et="" l'infiltration="" des="" cellules="" inflammatoires.="" les="" résultats="" immunohistochimiques="" ont="" montré="" que="" les="" cphg="" réduisaient="" de="" manière="" significative="" l'expression="" de="" tgf-="" 1="" (p="">< 0,="" 01,="" p="">< 0,="" 01="" et="" p="">< 0,="" 01),="" col-i="" et="" col-iii.="" les="" effets="" in="" vitro="" des="" cphg="" (100,="" 75,="" 50="" et="" 25="" ug="" ml)="" sur="" hsc-t6="" ont="" montré="" que="" les="" cphg="" réduisaient="" de="" manière="" significative="" l'expression="" de="" l'arnm="" de="" nf-κb="" p65="" et="" col-i,="" et="" que="" les="" cphg="" réduisaient="" également="" l'expression="" de="" la="" protéine="" col-i.="" conclusions :="" les="" cphg="" ont="" un="" effet="" anti-fibrose="" hépatique="" significatif="" et="" peuvent="" être="" utilisés="" comme="" agents="" hépatoprotecteurs="" pour="" le="" traitement="" de="" la="" fibrose="">

Mots-clés : Fibrose hépatique, Cistanche tubulosa, Phenylethanol glycoside, Chemokine BSA, Prévention et thérapie.

Arrière plan

La fibrose hépatique est une réponse de cicatrisation à une lésion hépatique grave qui se produit dans la pathogenèse de l'hépatite chronique induite par divers facteurs. Ces facteurs sont l'infection virale, l'abus d'alcool, la cholestase et les maladies métaboliques et auto-immunes [1–3]. L'accumulation progressive de matrice extracellulaire (ECM) et la diminution du remodelage perturbent l'architecture normale du foie, entraînant une fibrose hépatique [4]. La fibrose hépatique est critique dans les maladies chroniques du foie et se développe souvent en cirrhose irréversible et en carcinogenèse. À l'heure actuelle, il n'existe pas de méthodes ou de médicaments efficaces pour le traitement de la fibrose hépatique. Par conséquent, il est urgent de trouver un médicament contre la fibrose hépatique qui atténuera la progression des lésions hépatiques vers la fibrose et le cancer.Cistanche tubulosaW (de la famille des Orobanchaceae) est une plante parasite largement cultivée dans la région méridionale du Xinjiang en Chine [5]. Les gens l'utilisent généralement pour revigorer les reins, nourrir le sang, détendre les intestins et retarder la sénescence. Il est officiellement répertorié dans la pharmacopée chinoise [6]. C. tubulosa contient une variété de composants actifs. Ceux-ci inclusGlycosides de phényléthanol de cistanche(CPhG), des iridoïdes et des polysaccharides. Comme l'un des nombreux composants actifs deC. tubulosa, les CPhG ont montré des effets antioxydants, anti-fatigue, neuroprotecteurs et anti-inflammatoires convaincants dans des études in vivo et in vitro [7]. Ces dernières années, il a été signalé que les CPhG (Glycosides de phényléthanol de cistanche) ont des effets hépatoprotecteurs. Les mécanismes potentiels sous-jacents à ces effets sont le piégeage des radicaux libres, la protection des membranes hépatiques, l'immunorégulation, l'inhibition de l'apoptose, l'inhibition de l'expression de HBsAg et HBeAg, et l'inhibition de la réplication de l'ADN du VHB et autres [8-11]. Cependant, peu d'études dans la littérature traitent de l'effet anti-fibrosant hépatique des graphiques. Par conséquent, cette étude visait à étudier l'effet anti-fibrose hépatique des GPhC en utilisant un modèle de fibrose hépatique induite par l'albumine sérique bovine (BSA) chez le rat. Les mécanismes moléculaires associés ont été étudiés dans les cellules HSC-T6.

Méthodes

produits chimiques et réactifs

Un kit Hydroxyproline (hydrolyse alcaline) (Lot : 20140616) a été acheté auprès de Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Chine). Les kits ELISA sandwich TGF - 1 de rat (lot : 238240615) ont été achetés auprès de Lianke Biotech Co., Ltd. (Chine). L'anticorps de lapin anti-collagène I (lot : 140619), l'anticorps de lapin anti-collagène III (lot : 980788 W) et l'anticorps de lapin anti-TGF- 1 (lot : 140619) ont été fournis par Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., LTD (Chine). Inclus avec du sérum de mouton normal (liquide de travail) (Lot : WP141214), PV-6000 (Lot : WK141225) et le kit DAB (Lot : K136621D) ont été achetés auprès de Zhongshan Golden Bridge Biotech Co., Ltd. (Chine) . La détection des anticorps primaires a été réalisée en utilisant 2. Solution d'anticorps (Alk-Phos. Conjugué, Anti-lapin) et 2. Solution d'anticorps (Alk-Phos. Conjugué, Anti-souris) (lot : 272387) achetée auprès de la société Invitrogen (États-Unis). ). L'albumine de sérum bovin (BSA) (Lot : SLBG8239V) a été achetée chez Sigma (USA). Avant utilisation, la BSA a été préparée à 18 g/L dans une solution saline normale, les bactéries ont été éliminées par filtration et la BSA a été stockée à 4 degrés. L'adjuvant incomplet de Freund contenant 1 g de lipide de poils de mouton (Lot : AF0220LA14, Shanghai yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (Chine) a été mélangé avec 2 g de paraffine liquide (Lot : 20130815, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., (Chine), stérilisé dans un autoclave à vapeur et stocké à 4 degrés. Le médicament positif BJRG a été obtenu sous forme de comprimés Biejiarangan de Inner Mongolia Furui Medical Science Co., Ltd (Chine). Les stocks de médicaments BJRG ont été préparés en dissolvant Comprimés de BJRG dans de l'eau distillée à une concentration de 600 mg/kg.

Matières végétales

C. tubulosa(famille Orobanchaceae) a été achetée dans la région de Minfeng au Xinjiang en Chine. Le matériel a été authentifié par le chercheur Jun Zhao, Key Laboratory for Uighur Medicine, Institute of Materia Medica of Xinjiang. Des spécimens de bon ont été déposés à l'Institut de Materia Medica du Xinjiang.

Préparation des CPhG(Glycosides de phényléthanol de cistanche)

Rhizomes séchés et tranchés deC. tubulosa(6,0 kg) ont été extraits consécutivement au reflux trois fois avec 70 % d'éthanol, et le solvant a été éliminé pour donner l'extrait à l'éthanol. Les extraits d'éthanol ont été purifiés à l'aide de résine AB-8 pour obtenir les glycosides de phényléthanol (CPhG). Les solutions mères de CPhG utilisées pour différents groupes de doses dans les études animales (500 mg/kg, 250 mg/kg et 125 mg/kg, respectivement) ont été dissoutes dans 0,5 % (5 g/L) de carboxyméthylcellulose (sel de sodium).

Quantification des CPhG(Glycosides de phényléthanol de cistanche)

Le contenu de deux composants (échinacoside et actéoside) dans les CPhG a été déterminé par HPLC en utilisant une méthode rapportée précédemment (Zhang et al. 2004) [12]. La HPLC a été réalisée à l'aide d'un Shimadzu LC-10A HPLC équipé d'un détecteur UV. La colonne HPLC était une colonne Phenomenex Gemini ODS (250 × 4,6 mm, 5 μm). La phase mobile isocratique était constituée de méthanol-acétonitrile -1 pour cent d'acide acétique (15:10:75, v/v/v). L'élution a duré 40 min et le débit a été maintenu à 0,6 mL/min. La température de la colonne a été maintenue constante à 30 degrés. La détection UV était à 334 nm.

Animaux et lignée cellulaire HSC-T6

[Grade SPF] Des rats Sprague-Dawley (SD) mâles adultes en bonne santé (180-220 g) ont été achetés auprès du Xinjiang Medical University Animal Center, numéro de licence : SCXK (nouveau) 2011-0004. Les rats ont été nourris avec de la nourriture sans pathogène spécifique (SPF). Toutes les procédures liées aux expérimentations animales ont été approuvées par le Comité d'éthique animale du premier hôpital affilié de l'Université médicale du Xinjiang. Les rats ont été logés dans des cages dans des conditions environnementales contrôlées (25 degrés et un cycle lumière / obscurité de 12 h) et avaient libre accès à la nourriture standard en granulés pour rats et à l'eau du robinet. Les rats ont été acclimatés avant le traitement. Une lignée cellulaire étoilée hépatique de rat immortalisée, HSC-T6, a été obtenue auprès de Wuhan Procell Gene Biotechnology Co., LTD. (Wuhan, Chine). Les cellules HSC-T6 ont été cultivées dans du milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (High Glucose) (DMEM, Pékin, Chine) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (Gibco, Amérique du Sud), 100 UI/ml de pénicilline et 100 ug/ml de streptomycine (Beijing , Chine) dans un incubateur humidifié à 37 degrés avec 5 % de CO2.

Lésions hépatiques induites par la BSA et traitements

Soixante-quinze rats SD ont été divisés au hasard en six groupes : normaux (traités à l'eau distillée), modèles (traités à la BSA), médicaments positifs (traités à la BSA plus BJRG 600 mg/kg/jour) et traités à la BSA plus CPhG.(Glycosides de phényléthanol de cistanche)(125, 250, 5{{20}}groupes de 0 mg/kg/jour). Les groupes traités à la BSA plus CPhG (125, 250, 500 mg/kg/jour) avaient 13 rats dans chaque groupe, et l'autre groupe avait 12 rats dans chaque groupe. Le modèle de lésion hépatique induite par la BSA est divisé en une sensibilisation primaire suivie d'une attaque immunologique) [13]. À l'exception du groupe normal, les autres groupes ont reçu de multiples injections sous-cutanées avec 0,5 ml (9 mg/ml) d'adjuvant incomplet de BSA de Freund le jour 1, le jour 15, le jour 22, le jour 29 et le jour 36 pour la sensibilisation primaire. Sept jours après la cinquième injection, du sang a été prélevé à travers le plexus veineux rétinien du rat et testé pour les anticorps anti-albumine sérique. L'anticorps BSA dans le sérum de rat a été détecté par une méthode de double diffusion sur gélose. L'injection d'attaque a été réalisée en administrant 0,4 ml de BSA dans une solution saline normale par la veine caudale chez des rats positifs aux anticorps BSA deux fois par semaine pendant dix fois. Les concentrations et les temps d'injection étaient de 5.00, 5.50, 6.00, 6.50, 7.00, 7.50, 8.50, 9.00, 9.50 et 10.00 g/L au jour 46, au jour 50, au jour 53, au jour 57, au jour 60, au jour 64, au jour 67, au jour 71, au jour 74 et au jour 78, respectivement. Dans le groupe normal, une solution saline normale a été utilisée pour les injections immunologiques primaires (sensibilisation) et secondaires (attaque) au lieu de BSA, et les autres conditions étaient les mêmes que celles du groupe modèle. Le groupe normal a reçu de l'eau distillée par voie orale à une dose de 10 ml/kg/jour. Le groupe modèle a reçu par voie orale 10 ml/kg/jour de solution de CMC-Na à 0,5 %. Le groupe médicamenteux positif a reçu par voie orale 600 mg/kg/jour de BJRG. Les CPhG traités à la BSA plus (125,

250 et 500 mg/kg/jour) ont reçu par voie orale des CPhG de 125, 250 et 500 mg/kg/jour(Glycosides de phényléthanol de cistanche), respectivement. L'administration quotidienne aux rats s'est poursuivie pendant deux semaines après la dernière injection. Après la période expérimentale, les rats ont été mis à jeun pendant 12 h avant de recevoir 10 % d'hydrate de chloral, puis immédiatement euthanasiés. Des échantillons de sérum ont été prélevés sur chaque rat et immédiatement utilisés. Les foies ont été récoltés à deux fins : (1) conservation dans de l'azote liquide pour les kits Hyp et (2) fixation dans du formaldéhyde à 10 % pour les examens histologiques et immunohistochimiques. La durée totale des études animales était de 93 jours.

Indices du foie et de la rate

Le foie et la rate ont été disséqués par laparotomie et lavés avec des solutions salines normales à 4 degrés. Après avoir absorbé l'excès d'eau avec du papier filtre, le foie et la rate ont été pesés pour calculer les indices correspondants : poids relatif des organes=masse des organes (g)/masse corporelle individuelle (g) × 100 % [14].

Expériences cellulaires

Les cellules HSC-T6 ont été étalées dans une plaque à puits 96-. Initialement, les cellules ont été cultivées avec du DMEM contenant 10 % de FBS pendant 48 h. Le milieu a ensuite été remplacé par du DMEM sans FBS pour affamer les cellules pendant 12 h. Les cellules ont ensuite été cultivées avec du DMEM contenant 5,0 ng/mL de TGF- 1 (sans FBS) pendant 24 h. Enfin, différentes concentrations de CPhG(Glycosides de phényléthanol de cistanche)(100 ug/ml, 50 ug/ml et 25 ug/ml), actéoside (6 ug/ml, 3 ug/ml et 1,5 ug/ml) et échinacoside (500 ug/ml, 250 ug/ml et 125 ug/ml) ont été réalisées dans la plaque en quadruple puits et incubées pendant 48 h.

Analyse PCR en temps réel

Le niveau d'expression de l'ARNm de NF-κB, p65 et collagène I a été déterminé par PCR en temps réel. Pour déterminer les expressions d'ARNm dans les cellules HSC-T6, les cellules (4 × 105 cellules) ont été ensemencées dans des plaques à six puits avec 3 ml de DMEM avec 10 % de FBS et incubées pendant une nuit à 37 degrés et 5 % de CO2, après quoi le milieu de culture cellulaire ont été remplacés par du DMEM sans sérum. Ensuite, les CPhG(Glycosides de phényléthanol de cistanche)(100 ug/ml, 50 ug/ml et 25 ug/ml), l'actéoside (6 ug/ml, 3 ug/ml et 1,5 ug/ml) et l'échinacoside (500 ug/ml , 250 ug/ml et 125 ug/ml) ont été ajoutés aux puits. Après 48 h d'incubation avec des CPhG ou des compositions monomères, l'ARN total a été extrait à l'aide du réactif TRIzol (Invitrogen, USA) et agité vigoureusement avec du chloroforme pendant 15 s. Après avoir reposé à température ambiante pendant 3 min, le lysat a été centrifugé à 12,000 × g pendant 15 min à 4 degrés. L'ARN dans la phase aqueuse a été précipité avec de l'isopropanol et la phase aqueuse supérieure a été transférée dans un nouveau tube de microcentrifugeuse. L'ARN a été précipité en ajoutant 0,75 % d'éthanol, après quoi le tube de microcentrifugeuse et centrifugé à 12 000 × g à 4 degrés pendant 5 minutes au maximum. Le surnageant a été retiré et l'ARN a été séché à température ambiante pendant 5 à 10 min. Ensembles spécifiques d'amorces (Sangon, Shanghai, Chine) qui ont été utilisés pour l'amplification de l'actine de rat [GenBank : NM_031144.3], du collagène I [GenBank : NM_ 053304.1] et de la NF Les gènes -κB p65 [GenBank : NM_199267.2] ont été conçus à l'aide de l'amorce de lot 3. Les amorces directes (fw) et inverses (rv) étaient les suivantes : Collagène I (fw : GGA GAG AGC ATG ACC GAT GG , rv : GGG ACT TCT TGA GGT TGC CA), NF-κB p65 (fw : CAT ACG CTG ACC CTA GCC TG, rv : TTT CTT CAA TCC GGT GGC GA), -actine (fw : TAA GGC CAA CCG TGA AAA GAT G, rv : AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A). Les résultats ont été normalisés par rapport à l'ARNm du gène domestique -actine en tant que contrôle interne et sont présentés sous forme de niveaux relatifs d'ARNm. Les réactions ont été effectuées avec 8 μL iQ SYBR Green Supermix, 1 μL de paire d'amorces 10 pM, 8,5 μL d'eau distillée et 2,5 μL d'ADNc. Chaque réaction en chaîne par polymérase a été réalisée dans les conditions suivantes : 95 degrés pendant 3 min, puis 40 cycles de 10 s à 95 degrés, 30 s à 55 degrés et 10 s à 55 degrés - 95 degrés pour l'extension, suivis d'une seule mesure de fluorescence . Les résultats finaux ont été décrits avec les valeurs relatives (2-ΔΔCt). Le calcul et l'analyse ont été effectués par le système de détection PCR en temps réel iQ5.

Analyse Western blot

Les niveaux d'expression des protéines de collagène I (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni, n° d'article : ab34710) ont été déterminés par Western blot [avec -actine (Lot : 60008-1-lg ; Proteintech, Chine) comme contrôle interne. Des extraits de cellules entières ont été préparés à l'aide d'un tampon de test de radioimmunoprécipitation (RIPA) (Thermo Scientific, États-Unis) avec un cocktail d'inhibiteurs de protéase Halt à 1% (Thermo Scientific, États-Unis) et des cocktails d'inhibiteurs de phosphatase Halt à 1% (Thermo Scientific, États-Unis). La concentration en protéines a été mesurée et quantifiée par la méthode de Bradford [18]. Les protéines (10 à 50 ug) ont été séparées sur un gel SDS-PAGE à 10 % et transférées sur des membranes PVDF (Millipore, États-Unis). Les membranes ont été bloquées pendant 1 h à température ambiante avec 5% de BSA et les anticorps primaires (anticorps anti-collagène I, dilution 1:200 ou mAb de souris d'actine, dilution 1:5000) ont été incubés à 4 degrés pendant la nuit. L'Alk-Phos correspondant. les anticorps secondaires conjugués ont été incubés à température ambiante. Enfin, les membranes ont été lavées trois fois avec une solution saline Tris – HCl 1 × avec 0, 1% de Tween 20, et les signaux ont été scannés et visualisés par le système d'imagerie GEL DOC XR (Bio-Rad). L'analyse densitométrique a été réalisée sur les protéines d'intérêt et normalisées à l'actine par le logiciel GEL DOC Image Studio (Bio-Rad). -actin a été utilisé comme contrôle interne.

analyses statistiques

Le test de normalité de Shapiro-Wilk et le test d'homogénéité de la variance de Levene ont été appliqués pour vérifier la normalité et You et al. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences (2015) 23:52 Page 4 sur 13homogénéité de la variance. L'analyse de la variance (ANOVA) suivie du test post-hoc de Tukey a été utilisée pour identifier les différences statistiques dans les données homogènes et normalement distribuées. Le test non paramétrique de Kruskal-Wallis a été utilisé pour analyser des données non distribuées normalement ou homogènes. Les résultats ont été exprimés en moyenne ± ET. La signification a été fixée à P < 0.05.="" toutes="" les="" données="" ont="" été="" analysées="" par="" le="" logiciel="" spss="" 16.0="" (xinjiang="" medical="">

Résultats

Détermination quantitative des CPhG

Les CPhG de C. tubulosa contiennent deux glycosides d'alcool phényléthylique, l'échinacoside et l'actéoside, et leur contenu dans les CPhG a été déterminé par analyse HPLC (Fig. 1) comme étant de 42,71 ± 0 0,42 % et 14,27 ± {{7 }}.18 pour cent, respectivement.

Indices du foie et de la rate

Comme le montre le tableau 1, les indices du foie et de la rate du groupe modèle ont été significativement élevés [P < 0.01,="" p="">< 0,05].="" les="" indices="" hépatique="" et="" splénique="" du="" médicament="" positif="" bjrg="" et="" cphg="" à="" différents="" groupes="" de="" doses="" ont="" été="" significativement="" réduits="" par="" rapport="" au="" groupe="" modèle="" [pliver="0.004," pliver="0.003," pliver="0." 004,="" pliver="0.005 ;" pspleen="0.017," pspleen="0.027," pspleen="0.024," pspleen="0.070," respectivement].="" les="" indices="" du="" foie="" et="" de="" la="" rate="" étaient="" inférieurs="" à="" ceux="" du="" groupe="">

Effets des CPhG sur les activités ALT, AST et les marqueurs de fibrose hépatique

Dans la présente étude, les taux sériques des enzymes hépatiques AST et ALT ont été significativement augmentés dans le groupe modèle, reflétant les dommages hépatocellulaires chez les rats atteints de fibrose hépatique induite par la BSA. Cependant, les expériences.

a montré que le traitement avec BJRG (600 mg/kg) et CPhG (125, 250 et 5{{10}}0 mg/kg) réduit significativement l'AST [PASSÉ < 0.0{{60}}1,="" passé="">< 0.001,="" passé="">< 0,001,="" passé="">< 0,001="" ,="" respectivement]="" et="" alt="" [palt="0.117," palt="0.139," palt="0.189," palt="0.255," respectivement]="" niveaux="" chez="" les="" rats="" atteints="" de="" fibrose="" hépatique="" .="" (tableau="" 2).="" les="" niveaux="" de="" ha,="" ln,="" pc="" et="" iv-c="" chez="" les="" rats="" modèles="" ont="" été="" significativement="" augmentés="" [pha="">< 0,001,="" pln="">< 0,001,="" ppciii="0.002," piv-c="">< 0,001,="" respectivement].="" par="" rapport="" au="" groupe="" modèle,="" les="" niveaux="" de="" ha="" [pha="0.009," pha="0.007," pha="0.009," pha="0.023," respectivement],="" ln="" [pln="0.011," p="" ln="0.004," p="" ln="0.026," p="" ln="0.069," respectivement],="" pc="" iii="" [p="" pciii="" {="" {47}}.006,="" p="" pciii="0.067," p="" pciii="0.136," p="" pciii="0.296," respectivement]="" et="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" respectivement]="" chez="" les="" rats="" ont="" été="" nettement="" diminués="" par="" le="" bjrg="" (600="" mg/kg)="" et="" les="" cphg="" à="" différents="" groupes="" de="" doses="" (125,="" 250="" et="" 500="" mg/kg)="" (tableau="" 3).="" teneur="" en="" hyp="" et="" tgf-="" 1="" la="" teneur="" en="" collagène="" a="" également="" été="" détectée="" en="" mesurant="" les="" niveaux="" de="" hyp="" dans="" le="" tissu="" hépatique.="" comme="" le="" montre="" le="" tableau="" 4,="" la="" moyenne="">niveau dans le groupe modèle était significativement plus élevé que le groupe normal, mais il a été nettement diminué dans le groupe BJRG et les différents groupes de dose CPhGs. La concentration hépatique de TGF{{0}} du groupe modèle chez les rats a été significativement augmentée [P < 0.001].="" par="" rapport="" au="" groupe="" modèle,="" les="" niveaux="" de="" tgf-="" 1="" du="" médicament="" positif="" et="" des="" différents="" groupes="" de="" doses="" de="" cphg="" ont="" été="" nettement="" diminués="" [p="" tgf-="" 1="">< 0.001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0,001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0,001,="" ptgf-="" 1="">< 0,001,="" respectivement].="" les="" résultats="" sont="" résumés="" dans="" le="" tableau="">

Examen histopathologique

Les observations de coupes de tissu hépatique normal colorées avec H&E et le trichrome de Masson présentent des lobules hépatiques et des sinusoïdes hépatiques distincts. La structure du tissu hépatique chez les rats modèles était désordonnée et le tissu hépatique et les sinusoïdes hépatiques ont été remplacés par une grande quantité de tissu conjonctif. Cependant, une cytoarchitecture plus normale et moins de tissu conjonctif ont été détectés dans le groupe de traitement que ceux du groupe modèle.

Coloration H&E

Dans le groupe normal, l'intégrité structurelle du lobule hépatique sans zones portales anormales et sinusoïdes hépatiques a été observée. Les cordons hépatiques étaient disposés de manière ordonnée, avec le noyau rond et clair. Les noyaux sont situés au centre de la cellule, avec un cytoplasme abondant. Seule la zone porte a une petite quantité de tissu fibreux (Fig. 2a). Dans le groupe modèle, la structure lobulaire était gravement endommagée. Les cellules hépatiques ont montré une légère dégénérescence aqueuse, principalement une dégénérescence gonflée et/ou une dégénérescence graisseuse. La formation d'une infiltration cellulaire inflammatoire, une hyperplasie étendue du tissu fibreux, la formation d'un grand nombre de septum fibreux, des lobules fendus et une prolifération significative des cellules hépatiques ont également été observées. Ces observations ont confirmé le succès de la mise en place du modèle animal de lésion immunitaire chez le rat de la fibrose hépatique (Fig. 2b). Par rapport au groupe modèle, il y avait une réduction de l'infiltration des cellules inflammatoires dans les différents CPhG. On a également observé moins de nécrose et de dégénérescence graisseuse des cellules hépatiques ainsi qu'un soulagement de la fibrose. Les CPhG ont considérablement atténué la pathologie de la fibrose hépatique induite par la BSA chez le rat, atténué le gonflement des cellules hépatiques et empêché efficacement la nécrose des hépatocytes et l'infiltration des cellules inflammatoires, ce qui suggère que les CPhG exercent un effet protecteur sur la fibrose hépatique du rat induite par la BSA. (Fig. 2c–f). Coloration au trichrome de Masson Dans le groupe normal, le tissu hépatique était normal. La zone porte hépatique présentait un petit nombre de fibres de collagène bleues et le tissu hépatique était normalement structuré (Fig. 3a). Comparé au tissu hépatique du groupe normal, le tissu fibreux a proliféré par le feuillet central et s'est étendu dans le parenchyme hépatique. Fibres de collagène étendues et liées et

enveloppait tout le lobule et entourait la veine centrale. Ces effets, ainsi que la fibrose des hépatocytes, les dommages structurels lobulaires, la fibrose périportale et la formation de pseudolobules (Fig. 3b) ont fourni la preuve que le modèle était établi. Par rapport au groupe modèle, les fibres de collagène du groupe témoin positif au médicament étaient légèrement étendues vers l'extérieur à partir de la zone porte périphérique (Fig. 3c). Par rapport au groupe modèle, les fibres de collagène dans les différents groupes de doses de CPhG ont été significativement réduites, la prolifération des fibres a été inhibée et la prolifération du tissu fibreux dans le parenchyme hépatique a été significativement réduite. Ces résultats suggèrent que les CPhG protégeaient les rats de la fibrose hépatique induite par la BSA (Fig. 3d – f).

Coloration immunohistochimique

Il est important de noter que l'expression du collagène de type I et du collagène de type III joue un rôle essentiel dans le développement de la fibrose hépatique, et leur génération et leur dépôt dans le tissu hépatique pourraient constituer un déterminant important de l'efficacité anti-fibrose hépatique. Les résultats sont résumés dans le tableau 5

Collagène de type I

Le groupe normal exprimait le collagène de type I principalement dans les vaisseaux sanguins et la zone porte. Le groupe modèle exprime fortement la fibrose vasculaire de collagène de type I dans les zones portales. Dans l'espace de Disse, la coloration du collagène de type I a été observée en stries ou en distribution inégale. Des septa fibreux enveloppés de collagène forment un pseudolobule. Dans ces expériences, moins de cloisons fibreuses ont été formées pour la BJRJ (600 mg/kg) et différents groupes de doses de CPhGs (125, 250 et 500 mg/kg) [PCol I=0.002, PCol I {{ 6}}.001, PCol I=0.023 et P Col I=0.044, respectivement]. Les résultats semi-quantitatifs ont révélé que l'expression de leur collagène de type I était significativement plus faible par rapport au groupe modèle (Fig. 4).

Collagène de type III

Le collagène de type III était faiblement exprimé dans le groupe normal et les zones périphériques entourant les veines porte et hépatique présentaient une petite quantité de fines fibres jaunes au lieu de fibres continues (Fig. 5a). Dans le groupe modèle, les fibres de collagène présentaient des cordons larges et épais, indiquant une forte expression, principalement localisée dans les zones porte et tissu fibreuse (Fig. 5b). Les fibres de collagène de BJRJ (600 mg/kg) et de différents groupes de doses de CPhG (125, 250 et 500 mg/kg) étaient filamenteuses et distribuées autour de la veine centrale et des zones portales. Par rapport au groupe modèle, les fibres de collagène étaient significativement réduites, la coloration était pâle et fine et la coloration immunohistochimique était faiblement positive (Fig. 5c – f). Ces résultats semi-quantitatifs montrent que les cellules exprimées positivement dans les groupes de doses positives et différentes [PCol III=0.015, PCol III=0.001, PCol III=0.010, et P Col III=0.037, respectivement] étaient différents de ceux du groupe modèle.

TGF- 1

Il y avait peu d'expression de TGIF{{0}} dans les cellules hépatiques normales de rat. L'expression était limitée à un petit nombre de cellules interstitielles (Fig. 6a). Dans le groupe modèle, l'expression du TGF- 1 était largement distribuée dans la zone porte, les espaces fibreux, les cellules étoilées hépatiques, les cellules inflammatoires, la paroi sinusoïdale et le cytoplasme. Une zone porte particulière présentait une expression fortement positive avec une coloration jaune brunâtre (Fig. 6b). Il y avait une petite quantité d'expression dans la zone porte et les septa fibreux de BJRJ (600 mg/kg) et différents groupes de doses de CPhG (125, 250 et 500 mg/kg). L'étendue de la coloration positive dans ces groupes était significativement réduite par rapport à celle du groupe modèle. La coloration des cellules interstitielles dans les septa fibreux et le cytoplasme des cellules inflammatoires a diminué (Fig. 6c – f). Les résultats semi-quantitatifs ont révélé que la BJRJ et différents groupes de doses de CPhG [P TGF- 1=0.001, P TGF- 1 < 0,001, p="" tgf-="" 1="0.009," ptgf-="" 1="0" 0,004,="" respectivement]="" étaient="" significatifs="" par="" rapport="" au="" groupe="" modèle.="" comme="" mentionné="" précédemment="" dans="" l'article,="" le="" tgf-="" 1="" est="" une="" cytokine="" importante="" dans="" la="" physiopathologie="" du="">

fibrose, stimulant la production de matrice extracellulaire [19]. Nous avons montré que le niveau de TGF- 1 augmentait dans le groupe modèle d'une manière cohérente avec la sévérité de la fibrose hépatique. Les niveaux d'expression de TGF- 1 dans le foie étaient compatibles avec les niveaux sériques de TGF- 1. Cela indique que les CPhG peuvent réduire de manière significative la fibrose hépatique due à l'expression du TGF- 1 en participant à la synthèse et à la dégradation de l'ECM. L'expression du collagène de type I, du collagène de type III et du TGF- 1 peut détecter le processus pathologique de la fibrose hépatique. Leurs niveaux d'expression dans les groupes de traitement ont été significativement diminués et ont illustré que les CPhG peuvent améliorer l'activité de la collagénase, maintenir l'équilibre dynamique de la synthèse et de la dégradation de l'ECM hépatique, retardant et empêchant ainsi la formation de fibrose hépatique.