Partie II.: Mécanisme de régulation de l’autophagie chez les souris induites par MPTP via la voie de signalisation MTOR par Echinacoside

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Amélioration des symptômes neurocomportementaux chez les souris induites par MPTP par Echinacoside

Echinacoside a raccourci le temps d’escalade chez les souris induites par MPTP

Le tour T et le total T dans le groupe M étaient sensiblement plus longs que ceux du groupe N (P< 0.01).="" the="" t-turn="" and="" t-total="" in="" the="" eh="" group="" significantly="" decreased="" compared="" with="" those="" in="" the="" m="" group="" (p="">< 0.01).="" compared="" with="" the="" eh="" group="" and="" m="" group,="" the="" above="" two="" indexes="" in="" the="" cq="" group="" and="" wo="" group="" increased="" significantly="" (p="">< 0.01="" and="" p="">< 0.05,="" respectively).="" comparisons="" between="" the="" eh="" group="" and="" ra="" group="" showed="" there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" t-turn="" and="" t-total="" (as="" illustrated="" in="" figure="">

L’échinacoside est bon pour la santé

L’échinacoside a augmenté l’activité spontanée chez les souris induites par le MPTP

Le nombre d’élèves dans les cinq minutes et la distance totale dans les 30 minutes ont tous diminué de manière significative dans le groupe M par rapport à ceux du groupe N (P< 0.01).="" the="" above="" two="" indexes="" significantly="" increased="" in="" the="" eh="" group="" and="" the="" ra="" group="" compared="" with="" those="" in="" the="" m="" group="" (p="">< 0.01).="" compared="" with="" the="" eh="" group,="" the="" rearing="" number="" and="" the="" total="" distance="" significantly="" decreased="" in="" the="" cq="" group="" and="" the="" wo="" group="" (p="">< 0.01).="" there="" were="" no="" statistically="" significant="" differences="" in="" the="" above="" two="" indexes="" between="" the="" eh="" group="" and="" ra="" group="" (p="">0,05) (comme le montre la figure 1B).

Figure I Le neurocomportement chez la souris de chaque groupe.

(A) Le test des pôles chez la souris de chaque groupe∶ Temps de rotation (T-Tumn); Temps total dimping (下Totl).

(B) L’activité spontanée chez les souris de chaque groupe: Les temps d’érection dans les cinq minutes (nombre d’élevage); La distance de mouvement horizontale dans les 30 minutes (distance totale).

(C) L’analyse de la démarche chez les souris de chaque groupe: la longueur de foulée du membre antérieur; La longueur de foulée du membre postérieur.

(D) Le rotarod chez les souris de chaque groupe: Le temps de séjour sur le rotarod (également connu sous le nom de latence pour tomber)

Remarques:*P<0.05,**p><0.0i, compared="" with="" the="" model=""><0.0l, compared="" with="" the="" high-dose="">échinacosidegroupe, n = 6.

Echinacoside a prolongé les foulées des membres antérieurs et postérieurs chez les souris induites par MPTP

La foulée des membres antérieurs et postérieurs a été significativement réduite dans le groupe M par rapport à celles du groupe N (P< 0.01).="" the="" fore="" and="" hind="" limb="" stride="" significantly="" increased="" in="" the="" eh="" group="" and="" ra="" group="" compared="" with="" those="" in="" the="" m="" group="" (p="">< 0.01).="" compared="" with="" the="" eh="" group="" and="" the="" m="" group,="" the="" fore="" and="" hind="" limb="" strides="" were="" significantly="" reduced="" in="" the="" cq="" group="" and="" the="" wo="" group="" (p="">< 0.01="" and="" p="">< 0.05,="" respectively).="" there="" were="" no="" statistically="" significant="" differences="" in="" fore="" and="" hind="" limb="" strides="" between="" the="" eh="" group="" and="" ra="" group="" (as="" demonstrated="" in="" figure="">

Echinacoside a prolongé la latence à chuter chez les souris induites par MPTP

Le temps de séjour sur le rotarod, également connu sous le nom de latence de chute, a été significativement réduit dans le groupe M par rapport au groupe N (P< 0.01).="" the="" latency="" to="" fall="" significantly="" increased="" in="" the="" eh="" group="" and="" the="" ra="" group="" compared="" with="" the="" m="" group="" (p="">< 0.01).="" the="" latency="" to="" fall="" significantly="" reduced="" in="" the="" cq="" group="" and="" wo="" group="" (p="">< 0.01="" and="" p="">< 0.05,="" respectively)="" compared="" with="" the="" eh="" group="" and="" m="" group.="" there="" were="" no="" statistically="" significant="" differences="" in="" the="" latency="" to="" fall="" between="" the="" eh="" group="" and="" ra="" group="" (p="">0,05) (comme le montre la figure 1D).

Echinacosideest bon pour la santé

L’échinacoside a augmenté la teneur en DA et en métabolites dans le Striatum chez les souris induites par le MPTP

Par rapport au groupe N, les teneurs en DA, DOPAC et HVA dans le groupe M ont significativement diminué (P< 0.01).="" the="" contents="" of="" da,="" dopac="" and="" hva="" significantly="" increased="" in="" the="" eh="" group="" and="" the="" ra="" group="" compared="" with="" those="" in="" the="" m="" group="" (p="">< 0.01).="" compared="" with="" the="" eh="" group="" and="" m="" group,="" the="" contents="" of="" da,="" dopac,="" and="" hva="" significantly="" decreased="" in="" the="" cq="" group="" and="" the="" wo="" group="" (p="">< 0.01="" and="" p="">< 0.05,="" respectively).="" there="" were="" no="" statistically="" significant="" differences="" in="" the="" contents="" of="" da,="" dopac,="" and="" hva="" between="" the="" eh="" group="" and="" the="" ra="" group="" (p="">0,05) (comme le montre la figure 2A–C). Par rapport au groupe N, la teneur en 5-HT a significativement diminué dans le groupe M (P< 0.01),="" and="" the="" content="" of="" 5-ht="" in="" the="" eh="" group="" significantly="" increased="" (p="">< 0.01).="" compared="" with="" the="" eh="" group,="" the="" content="" of="" 5-ht="" significantly="" decreased="" in="" the="" cq="" group="" and="" the="" wo="" group="">< 0.01)="" (as="" demonstrated="" in="" figure="">

Figure 2 Détection du contenu des neurotransmetteurs dans le striatum par la méthode électrochimique en phase liquide à haute performance (HPLC-ECD).

(A) Dopamine (DA):

(B)acide dihydroxsyphénybacétique (DOPAC);

C) acide homovanllique (HVA);

(D) 5-hydroxytryptamine (5-HT).

Remarques:*P<><00 i.="" compared="" with="" the="" model="" group;=""><><001.compared with="" the="" high-dose="">échinacosidegroupe

L’échinacoside a augmenté l’expression de la TH chez la Substantia Nigra et diminué l’expression de la α-synucléine chez les souris

Tout d’abord, une double coloration par immunofluorescence a été effectuée pour la TH et la α-synucléine. Par rapport au groupe N, l’expression de TH dans la substantia nigra a significativement diminué dans le groupe M, tandis que l’expression de la α-synucléine a significativement augmenté. Cependant, par rapport au groupe M, l’expression de la α-synucléine a significativement diminué dans le groupe EH et le groupe RA. Les expressions de α-synucléine ont significativement augmenté dans le groupe CQ et le groupe WO, qui étaient encore plus élevées que dans le groupe M (comme le montre la figure 3).

Figure 3 Double coloration par immunofluorescence de la TH et de l’a-synucléine dans le nigra substantiel chez les souris de chaque groupe.

La figure montrait la double coloration par immunofluorescence de la tyrosine hydroxylase (TH)

α-synucléine dans la substantia nigra chez la souris de chaque groupe n = 6

le grossissement du microscope à fluorescence: 200×.TH a été saigné avec une fluorescence verte,

Le 2ème élève saignait avec une fluorescence rouge, le DAPI bleu représentait les nus.

Le chevauchement du 2ème rouge vert était la cellule positive à double coloration (jaune).

Ensuite, un transfert western a été adopté pour mesurer les deux indicateurs ci-dessus. Les résultats ont montré que l’expression protéique de TH dans le groupe M était significativement inférieure à celle du groupe N (P< 0.01).="" the="" protein="" expressions="" of="" th="" in="" the="" eh="" group="" and="" ra="" group="" significantly="" increased="" compared="" with="" that="" in="" the="" m="" group="" (p="">< 0.01).="" the="" protein="" expressions="" of="" th="" in="" the="" cq="" group="" and="" wo="" group="" were="" significantly="" decreased="" compared="" with="" that="" in="" the="" eh="" group="" (p="">< 0.01).="" the="" protein="" expression="" of="" α-synuclein="" in="" the="" m="" group="" also="" increased="" compared="" with="" the="" n="" group="" (p="">< 0.01).="" however,="" the="" protein="" expressions="" of="" α-="" synuclein="" in="" the="" eh="" group="" and="" the="" ra="" group="" significantly="" decreased="" compared="" with="" that="" in="" the="" m="" group,="" and="" the="" differences="" were="" statistically="" significant="" (p="">< 0.01).="" compared="" with="" the="" eh="" group="" and="" the="" m="" group,="" the="" protein="" expressions="" of="" α-synuclein="" in="" the="" cq="" group="" and="" the="" wo="" group="" increased="" significantly,="" and="" the="" differences="" were="" statistically="" significant="" (p="">< 0.01)="" (as="" shown="" in="" figure="">

Figure 4 Les changements dans les expressions protéiques de la TH et de la α-synucléine dans la nigra substantielle chez les souris de chaque groupe.

Notes∶甲P<><00i，compared with="" the="" model="" group;=""><><00i，compared with="" the="" high-dose="">échinacosidegroupe n=6.

L’échinacoside a diminué l’expression de P62 chez la Substantia Nigra chez les souris induites par le MPTP

Tout d’abord, un transfert Western a été adopté pour détecter l’expression protéique de P62. Les résultats ont révélé que l’expression protéique de P62 dans le groupe M augmentait sensiblement par rapport au groupe N (P< 0.01).="" the="" protein="" expressions="" of="" p62="" in="" the="" eh="" group="" and="" ra="" group="" decreased="" noticeably="" compared="" with="" the="" m="" group,="" and="" the="" differences="" were="" statistically="" significant="" (p="">< 0.01).="" compared="" with="" the="" eh="" group,="" the="" protein="" expressions="" of="" p62="" in="" the="" cq="" group="" and="" wo="" group="" increased="" noticeably="" (p="">< 0.01)="" (as="" shown="" in="" figure="" 5c).="" then,="" immunofluorescence="" staining="" was="" conducted="" for="" p62="" and="" dapi.="" it="" was="" found="" that="" compared="" with="" the="" n="" group,="" the="" p62="" in="" the="" substantia="" nigra="" increased="" more="" obviously="" in="" the="" m="" group,="" the="" expressions="" of="" p62="" decreased="" in="" the="" eh="" group="" and="" the="" ra="" group,="" and="" expressions="" of="" p62="" increased="" in="" the="" cq="" group="" and="" the="" wo="" group="" (as="" demonstrated="" in="" figure="">

Figure 5 Les changements des expressions protéiques de la coloration par immunofluorescence becin I, LC3ll P62 et P62 dans la substantia nigra chez la souris de chaque groupe.

Remarques:*P<><00l, compared="" with="" the="" model=""><>< 0.0i,="" compared="" with="" the="" high-dose="">échinacosidegroupe

Le grossissement du microscope à fluorescence : 200×. P62 a été marqué avec une fluorescence rouge. Le DAPI bleu représentait le nu, n= 6.

L’échinacoside a augmenté l’expression de Beclin 1 et LC3II chez la Substantia Nigra chez les souris induites par le MPTP

Tout d’abord, un transfert western a été adopté pour déterminer l’expression protéique de Beclin 1 dans la substantia nigra chez les souris de chaque groupe. Il a été constaté que l’expression protéique de Beclin 1 dans le groupe M augmentait significativement par rapport au groupe N (P< 0.01).="" however,="" the="" increases="" in="" protein="" expression="" of="" beclin="" 1="" in="" the="" eh="" group="" and="" the="" ra="" group="" were="" more="" obvious="" (p="">< 0.01).="" compared="" with="" the="" eh="" group="" and="" the="" m="" group,="" the="" protein="" expressions="" of="" beclin="" 1="" in="" the="" cq="" group="" and="" the="" wo="" group="" decreased="" significantly,="" and="" the="" differences="" were="" statistically="" significant="" (p="">< 0.01)="" (as="" demonstrated="" in="" figure="">

Parce que LC3 est un indicateur clé de l’autophagie, une double coloration a été effectuée pour TH et LC3. Les résultats ont montré que le nombre de cellules LC3 positives dans le groupe M a significativement augmenté par rapport à celui du groupe N. Le nombre de cellules LC3 positives dans le groupe EH et le groupe RA a augmenté de manière plus significative que dans le groupe M. Cependant, lors de l’utilisation de l’inhibiteur d’autophagie, le nombre de cellules LC3 positives dans le groupe WO était significativement inférieur à celui du groupe M, tandis que le nombre de cellules LC3 positives n’a pas diminué de manière significative dans le groupe CQ (comme le montre la figure 6). Ensuite, un transfert western a été utilisé pour détecter l’expression protéique de la CL3 dans la substantia nigra chez les souris de chaque groupe. Les résultats ont indiqué que l’expression protéique de LC3II dans le groupe M a significativement augmenté par rapport au groupe N (P< 0.01).="" protein="" expressions="" of="" lc3ii="" in="" the="" eh="" group,="" ra="" group,="" and="" cq="" group="" all="" increased="" significantly="" compared="" with="" the="" m="" group="" (p="">< 0.01).="" in="" the="" wo="" group,="" the="" protein="" expression="" of="" lc3ii="" decreased="" compared="" with="" the="" eh="" group="" and="" the="" m="" group,="" and="" the="" differences="" were="" statistically="" significant="" (p="">< 0.01="" and="" p="">< 0.05,="" respectively)="" (as="" demonstrated="" in="" figure="">

Echinacosideest bon pour guéririème

Les changements de l’ultrastructure et des autophagosomes de Substantia Nigra observés au microscope électronique à transmission

Grâce à l’observation de l’ultrastructure de la substantia nigra, il a été constaté que, à l’exception du groupe N, les souris présentaient toutes des degrés variables de lésion de l’ultrastructure de la substantia nigra, se manifestant par un gonflement des mitochondries, une expansion du réticulum endoplasmique rugueux, une expansion de Golgi, une augmentation des lysosomes et la formation d’autophagosomes à double structure membranaire. Le nombre d’autophagosomes dans le groupe EH, le groupe RA et le groupe CQ a significativement augmenté par rapport aux autres groupes. Le nombre d’autophagosomes dans le groupe CQ était plus élevé que dans celui du groupe M, ce qui était cohérent avec les résultats d’une augmentation de l’expression protéique de LC3II dans la double coloration de fluorescence et le transfert western. Il a également suggéré que le nombre de CL3II et d’autophagosomes était corrélé dans une certaine mesure. Il n’y avait pas d’augmentation évidente des autophagosomes dans le groupe WO, ce qui suggère que dans ce groupe, l’augmentation de l’autophagie causée paréchinacosidea été inhibé (comme le montre la figure 7).

Figure 7 Les changements ultrastructuraux et la formation d’autophagosomes dans la nigra substantielle chez les souris de chaque groupe.

(A) Le groupe témoin salin normal, avec la structure normale de la substantia nigra;

(B)le groupe modèle, avec les manifestations d’un gonflement des mitochondries, d’une expansion rugueuse du réticulum endoplasmique et de la formation de lysosome et d’autophagosome:

(C et D) leéchinacosidetravail. avec relativement plus de formation de lysosome et d’autophagosome:

(E) le groupe rapamycine, avec des manifestations de gonflement des mitochondries et de formation de lysosome et d’autophagosome;

(F)le groupe chloroquine, avec des manifestations de gonflement des mitochondries et de formation de lysosome et d’autophagosome:

(G et H) le groupe wortmannine. avec des mitochondries sensiblement gonflées, un rouch edopbs mik reticulum expansé

(G) et gonflement de mitochondri2. expansion du réticulum endoplasmique rugueux, expansion évidente des Gds et augmentation des mysosomes.

L’effet de l’échinacoside sur l’expression protéique de l’AKT et du mTOR chez Substantia Nigra chez les souris induites par le MPTP

Western blot a été utilisé pour détecter l’expression protéique de l’AKT et du mTOR dans chaque groupe. Les résultats ont révélé que par rapport au groupe N, l’expression protéique de p-AKT/AKT diminuait sensiblement dans le groupe M (P< 0.01).="" the="" protein="" expressions="" of="" p-akt/akt="" in="" the="" eh="" group="" and="" ra="" group="" increased="" noticeably="" compared="" with="" the="" m="" group="" (p="">< 0.01),="" and="" the="" protein="" expression="" of="" p-akt/akt="" in="" the="" eh="" group="" was="" higher="" than="" that="" in="" the="" ra="" group="" (p="">< 0.01).="" compared="" with="" the="" eh="" group,="" the="" protein="" expressions="" of="" p-akt/akt="" in="" the="" cq="" group="" and="" wo="" group="" decreased="" noticeably="" (p="">< 0.01)="" (as="" shown="" in="" figure="" 8).="" also,="" it="" was="" found="" that="" the="" protein="" expression="" of="" p-mtor/mtor="" in="" the="" m="" group="" was="" slightly="" lower="" than="" that="" in="" the="" n="" group="" (p="">< 0.05),="" but="" the="" decrease="" in="" protein="" expression="" of="" p-mtor/mtor="" was="" more="" significant="" in="" the="" eh="" group="" and="" the="" ra="" group="" than="" in="" the="" m="" group="" (p="">< 0.01).="" compared="" with="" the="" eh="" group,="" the="" protein="" expression="" of="" p-mtor/mtor="" increased="" in="" the="" cq="" group="" and="" the="" wo="" group="" (p="">< 0.01)="" (as="" demonstrated="" in="" figure="" 8,="" the="" lower="">

Figure 8 Les changements dans les expressions protéiques d’AKT et de mTOR dans le nigra substantiel chez les souris de chaque groupe.

Remarques : *P< 0.05,="" **p="">< 0.01,="" compared="" with="" the="" model="" group;="">< 0.01,="" compared="" with="" the="" high-dose="">échinacosidegroupe, n= 6.

Echinacosideest bon pour guéririème

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