Poly- et oligosaccharide Ulva Sp. Les fractions issues de l'extraction assistée par enzyme modulent le métabolisme 2
Aug 31, 2022
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3. Débat
Notre objectif principal est d'évaluer les activités biologiques potentielles des fractions poly- et oligosaccharidiques d'Ulon sp. obtenu après un procédé innovant d'extraction assistée par enzyme (EAE), connu pour améliorer le rendement d'extraction [5] et permettre un enrichissement significatif de la fraction en ulvanes par rapport à la macération [36], sur le métabolisme des fibroblastes dermiques de la peau humaine dans Culture.
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Un focus sur l'expression des composants de la matrice extracellulaire (ECM) de la peau impliqués dans la voie anabolique (en particulier les collagènes de type I et Ⅲ, GAGs et TIMP-1) et dans la voie catabolique (MMP-1) a été fait aux niveaux protéomique et transcriptomique. Dans ce travail, nous avons supposé qu'en raison de la composition élevée en glucides et en acides uroniques des fractions, l'activité est liée à la composition en ulvanes (poly- et oligosaccharides). Néanmoins, les auteurs ne doivent pas négliger le fait que les ulvanes polysaccharidiques d'Uloa sp. la paroi cellulaire sont étroitement liées aux protéines, qui sont également connues pour favoriser la production in vitro de collagène total et d'acide hyaluronique dans les fibroblastes dermiques humains [39]. Ainsi, les auteurs suggèrent que ces activités pourraient être liées à une synergie entre les ulvanes et les protéines, même si l'accent est mis sur les ulvanes dans ce manuscrit. 3.1.Action des fractions poly- et oligosaccharidiques Uloa de l'EAE sur le métabolisme des fibroblastes ECM
Des études antérieures ont démontré que des fractions d'Uloa sp.Extrait de Cistanche Anti Radiation(ulvanes brutes et ulvanes de bas poids moléculaire) ont la capacité de moduler la prolifération des fibroblastes dermiques humains normaux [36-38]. Nos résultats ont indiqué que les fractions poly- et oligosaccharidiques de l'EAE induisaient une augmentation significative de l'activité métabolique des fibroblastes (jusqu'à plus de 68 %). Ces résultats ont confirmé les données préliminaires publiées des auteurs [36] et des travaux antérieurs sur l'extrait d'Uloa pertusa hydrolysé à 250 ug/mL qui induisaient une prolifération importante de fibroblastes pré- et sénescents [38]. L'augmentation de l'activité métabolique n'a pas été accompagnée de l'effet de cytotoxicité des fractions (évalué par le dosage de la LDH), ce qui signifie que les résultats de bioactivité des fractions poly- et oligosaccharidiques Uloa de l'EAE ne sont pas biaisés par un effet cytotoxique dans la gamme des concentrations testées. Notre résultat est conforme aux études précédentes mettant en évidence les ulvanes en tant que composés non cytotoxiques sur différents types de cellules (lignées cellulaires de macrophages, cellules intestinales, fibroblastes, cellules de souris et cellules Vero) [13,14,4]
cistanche peut anti-âge
Comme mentionné dans l'introduction, les collagènes de type I et III et les GAG interagissent pour établir un réseau moléculaire pour l'assemblage de l'ECM dans le derme. Ainsi, dans cette étude, la synthèse protéique et l'expression au niveau de l'ARNm des principaux composants de la MEC du derme (collagènes de type I et Ⅲ, et GAG sulfatés et non sulfatés) ont été étudiées en présence de poly- et oligosaccharide Ullon sp. fractions de l'EAE. De plus, la MMP-1, une enzyme clé impliquée dans la dégradation du collagène de type I (voie du catabolisme de l'ECM) et son inhibiteur tissulaire TIMP-1 impliqué dans sa régulation ont également été évalués au niveau des protéines et de l'ARNm.
Les résultats ont révélé que les fractions Ulva poly- et oligosaccharidiques de l'EAE amélioraient la synthèse totale de collagène à 1000 ug/mL (jusqu'à plus 2 % évalués avec le test Red Sirius et des résultats significatifs sauf pour DEP-AD PP-UE). Ces résultats diffèrent d'une étude précédente où les vans bruts et les ulvanes de faible poids moléculaire n'ont aucun effet significatif sur la synthèse totale de collagène [37]. Cependant, nos résultats sont conformes aux travaux antérieurs, qui ont montré que les préparations de polysaccharides riches en L-rhamnose (ROP) des souches de Klebsiella pneumonia stimulent la synthèse de collagène [45]. En effet, les fibroblastes dermiques humains contiennent un site de lectine capable de reconnaître le -L-rhamnose [46]. De cette manière, la fraction rhamnose de la fraction ulvane peut être reconnue par le fibroblaste dermique humain et favoriser alors la synthèse de collagène. En particulier, la synthèse de collagène de type I a été augmentée pour toutes les fractions en ELISA (significatif pour UE et DS-UE) et dans les tests Western blot (NS). Ce résultat est conforme à la littérature antérieure sur les extraits hydrolysés d'Ulva pertusa [38] et les galactofucanes dépolymérisés (<10kda)from saccharina="" longicruris[47]="" which="" respectively="" increased="" the="" synthesis="" of="" type="" i="" pro="" and="" mature="" collagen.="" in="" our="" study,="" steady-state="" levels="" of="" col1al="" and="" col1a2="" were="" reduced="" after="" exposure="" to="" poly-and="" oligosaccharide="" ulva="" fractions(significant="" for="" col1a1="" at="" 1000="" ug/nnl="" for="" all="" fractions).expression="" in="" coordinated="" manner="" of="" col1al="" and="" col1a2="" genes="" complies="" with="" the="" fact="" they="" are="" both="" subunits="" of="" type="" i="" collagen="" protein="" [48].="" regulation="" between="" type="" i="" collagen="" protein="" production="" and="" mrna="" are="" different="" at="" the="" same="" observation="" time="" of="" 48="" h,="" which="" suggests="" a="" different="" potential="" time="" response="" regulation="" between="" protein="" and="" mrna[49].="" nevertheless,="" protein="" is="" the="" functional="" unit="" in="" ecm="" and="" exhibits="" an="" important="" increase="" after="" treatment="" with="" ulvans-derived="" eae="" fractions.="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" was="" increased="" (significantly="" for="" ue="" and="" ds-ue="" at="" 1000="" ug/ml)="" and="" correlated="" to="" an="" ns="" increase="" of="" type="" iii="" collagen="" synthesis="" evaluated="" by="" wb.="" moreover,="" the="" results="" showed="" that="" polysaccharide="" uloa="" fractions="" from="" eae="" (ue="" and="" ds-ue)="" boosted="" significantly="" gags(sulfated="" and="" non-sulfated)="" synthesis="" at="" 1000="" ug/ml,="" while="" both="" oligosaccharide="" fractions="" had="" no="" effect.="" our="" observations="" are="" in="" partial="" accordance="" with="" the="" work="" of="" adrien="" etal.="" (2017)="" in="" which="" the="" increase="" in="" hyaluronic="" acid="" production="" in="" fibroblasts="" occurred="" with="" both="" ulvans="" extracts="" (crude="" and="" low="" molecular="" weight="" ulvans)="" [37].="">cistanche herbeEn effet, dans notre étude, les ulvanes de bas poids moléculaire n'ont eu aucun effet sur la production de GAGs (y compris les GAGs non sulfatés d'acide hyaluronique).
Le vieillissement cutané étant caractérisé par un déséquilibre des composants de la MEC (diminution des niveaux de collagène de type I et II et des GAG), les fractions poly- et oligosaccharidiques obtenues à partir d'Uloa sp. après traitement EAE présentent un intérêt dans les stratégies anti-âge, car ils stimulent les collagènes de type I et III, et la synthèse des GAG.
Cependant, nos résultats ont également mis en évidence une augmentation de la synthèse, de l'activité et de l'expression génique de MP-1 en présence de fractions dérivées de poly- et oligosaccharides Uloa EAE. L'augmentation des niveaux d'ARNm de MMP-1 était corrélée à l'augmentation de la synthèse de MMP-1 en présence de fractions d'EAE dérivées d'Ulon et significativement pour les fractions polysaccharidiques (UE et DS-UE). L'augmentation de MMP La synthèse de l'enzyme -1 est également liée à une augmentation non significative de l'activité MMP-1 en présence des fractions. Notre résultat diffère de la littérature précédente puisque les extraits hydrolysés d'Uloa pertusa inhibent l'expression et la sécrétion de MMP-1 dans les fibroblastes sénescents[38], ou les polysaccharides contenant du fucose (nommés fucoïdanes) inhibent l'expression de MMP-1 induite par les UVB dans les fibroblastes cutanés humains [50]. Cependant, notre résultat est en accord avec l'étude de FRioux et al. (2013), puisque les galactofucanes bruts (638-1529 kDa) ont augmenté l'activité catalytique totale des MMP (y compris les MMP-1) des fibroblastes traités pendant 6 jours[47]. Nos données sur l'augmentation du niveau de MMP sont également en accord avec les travaux d'Andres et al. (2006), puisque les RROP (préparations d'oligosaccharides et de polysaccharides riches en rhamnose provenant des souches de Klebsiella pneumonia et de K. planticola) régulent à la hausse l'expression de MMP-9 [45]La synthèse améliorée de MMP-1 entraîne normalement une diminution de l'ECM quantité de composants tels que le collagène de type I en raison de l'activité de dégradation du MMP -1, mais cela n'a pas été souligné dans notre étude, car une augmentation du collagène de type I s'est produite. De plus, les fractions dérivées d'Uloa EAE n'ont eu aucun impact (augmentation ou diminution de la NS) sur le niveau d'expression de l'ARNm et la production de protéines de TIMP-1, un inhibiteur tissulaire de MP-1 (à l'exception de DEP-HD PP- UE avec une augmentation significative des protéines,p<0.05,at 1000="" μg/ml）.it="" appears="" that="" the="" anabolic/catabolic="" balance="" of="" ecm="" could="" be="" in="" favor="" of="" collagen="" synthesis="" despite="" mmp-1="" synthesis="" stimulation="" and="" activity.="" in="" this="" study,="" the="" authors="" thus="" showed="" that="" both="" poly-="" and="" oligosaccharide="" fractions="" derived="" from="" ulloa="" sp.="" after="" eae="" treatment="" are="" promoting="" fibroblast="" metabolism="" activity,="" ecm="" protein="" synthesis,="" and="" skin="" matrix="" renewal="" and="" remodeling,="" which="" is="" of="" interest="" for="" dermo-cosmetic="" applications="" in="" anti-aging="">
3.2.Rôle de l'abondance d'Ulvan, de la composition en sulfate et du poids moléculaire dans la modulation des fibroblastes ECM
La caractéristique structurelle des ulvanes qui englobe son degré de sulfatation, son schéma de sulfatation, sa composition en monosaccharides, ses liaisons glycosidiques, son degré de ramification, ainsi que son poids moléculaire est connue pour avoir un impact sur son activité biologique [10,1,37,40,44,51 ].
Des études antérieures ont montré que le poids moléculaire des composés bioactifs tels que les polysaccharides ou les protéines semble être un facteur clé de son effet sur la prolifération des fibroblastes et la modulation de la MEC [37,39,47]. Dans notre étude, les fractions polysaccharidiques, UE et DS-UE, de haut poids moléculaire (Mw > 670 kDa) ont augmenté la prolifération des fibroblastes. Bien que les fractions oligosaccharidiques (Mw<10 kda)="" also="" raise="" fibroblast="" proliferation,="" a="" dep-ad="" pp-ue="" fraction="" with="" lower="" molecular="" weight="" (mw="" of="" 1.5="" kda)="" has="" lower="" activity="" than="" dep-hd="" pp-ue="" (mw="" of="" 8="" kda).="" similar="" results="" were="" obtained="" on="" fibroblasts="" treated="" with="" rrops,="" since="" lower="" rrops="" exhibited="" similar="" or="" lower="" proliferation="" activity="" compared="" to="" higher="" mw="" rrops[45].="" polysaccharide="" fractions="" treatment="" also="" enhanced="" gags="" synthesis,="" total="" and="" especially="" type="" i="" and="" iii="" collagen="" synthesis,="" mp-1="" synthesis="" by="" human="" skin="" fibroblasts,="" whereas="" oligosaccharide="" fractions="" (low="" molecular=""><10 kda)="" and="" in="" particular="" dep-ad="" pp-ue="" (1.5="" kda)="" have="" lower="" capacities.="" only="" dep-hdpp-ue="" stimulated="" significatively="" total="" collagen="" synthesis="" and="" mp-1="" synthesis,="" while="" dep-ad="" pp-ue="" with="" lower="" molecular="" weight="" had="" no="" significant="" boost="" effect.="" these="" results="" are="" in="" accordance="" with="" work="" of="" kidgell="" et="" al.="" (2020)="" where="" higher="" molecular="" weight="" ulvan="" fractions="" elicited="" a="" greater="" biological="" activity="" (immunomodulatory="" response)="" compared="" to="" lower="" mw="" van="" fractions[44].="" these="" results="" are="" also="" in="" agreement="" with="" work="" of="" bodin="" et="" al.="" (20),="" since="" enzymatic="" hydrolyzed="" proteins="" from="" uloa="" intestinalis="" did="" not="" stimulate="" ecm="" material="" biosynthesis="" (collagen="" and="" hyaluronic="">
Les auteurs ont souligné que la meilleure bioactivité sur la synthèse des GAG était attribuée aux fractions de haut poids moléculaire des polysaccharides sulfatés enrichies en ulvanes bruts. Cela pourrait être lié à la composition intrinsèque des ulvanes dans les sulfates et à son poids moléculaire, puisque l'oligosaccharide Ulva sp. les fractions, partiellement complètement exemptes de sulfates, n'ont pas la capacité de stimuler la synthèse des GAG.croissance du pénis cistancheUne autre étude sur Ulku sp. ont montré l'importance du degré de sulfatation de l'ulvane sur l'activité biologique puisque la fraction d'Alvane chimiquement sulfatée, la teneur en sulfate doublée du polysaccharide natif, l'activité anticoagulante fortement améliorée synthèse, par rapport à l'UE. Cette meilleure bioactivité pourrait être liée à la plus grande abondance d'ulvanes et à la plus grande teneur en groupes sulfates dans la fraction dialysée par rapport aux autres fractions.
Nos données ont montré que le poly- et oligosaccharide Uloa sp. les fractions présentaient différentes activités métaboliques, qui peuvent être attribuées à l'abondance d'ulvane, à son degré de sulfatation et à sa structure chimique. Ce travail a également mis en évidence une meilleure activité pour les vans de haut poids moléculaire présentant des groupements sulfate. Le fait que les fractions polysaccharidiques riches en ulvanes bruts (c'est-à-dire non dépolymérisées) aient le plus d'effet sur le métabolisme des fibroblastes ECM est idéal pour les études à venir et ses futures applications potentielles dans les soins dermo-cosmétiques, car un traitement minimal diminue les coûts et le temps de production.
4. Matériels et méthodes
4.1. Matériel macroalgal
Algues vertes, Ulva sp. (Chlorophyta, Uvales, Ullvaceae), provient de la plage intertidale de Landrezac (47 degré 30 degré 17,9" N degré 2 degré 42 degré 37,1" O) à Sarzeau (Bretagne, France) le 28 mai 2018 dans l'après-midi à marée basse. Le matériau a été lavé à l'eau du robinet, broyé à un diamètre de 3 mm, congelé à -25 degré, lyophilisé (Alpha 1-4LSC, Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode am Harz, Allemagne) et stocké dans la pièce température dans l'obscurité.
4.2. Production et caractérisation des fractions poly- et oligosaccharidiques
Dans un précédent travail de Fournière et al. (2019), la production détaillée de fractions de polysaccharides et d'oligosaccharides à partir de l'extraction assistée par enzyme (EAE) a été décrite (voir la figure 9 et le tableau 3) [36].
Pour résumer brièvement, l'endo-protéase Protamex[(Novozymes, Bagsverd, Danemark) a été utilisée à 6 % (w/dw) sur Uloa sp. algue. L'hydrolyse enzymatique a été réalisée pendant 3 h à 50 degrés. Ensuite, l'extrait aqueux a subi une précipitation éthanolique (1:5, v Fisher Scientific, Illkirch, France) à 4 degrés pendant 244 h afin d'obtenir la fraction riche en ulvanes bruts (UE).
Ensuite, la fraction DS-UE a été produite après dialyse d'une fraction riche en Evans brut (10 mg/mL) pendant 7 jours à 4 degrés (seuil 12-14 kDa, Spectra/Por94 Dialysis Membrane, Spectrum Laboratories, Fisher Scientific ,Ilkirch,France).
Deux procédures de dépolymérisation (dépolymérisation radicalaire par H-OZ et dépolymérisation par résine échangeuse d'ions) ont été réalisées sur une solution de précipité éthanolique à partir d'une fraction riche en ulvanes bruts (25 mg/mL). Pour la dépolymérisation radicale, le peroxyde d'hydrogène (8 %, v/v , Fisher Scientific, Illkirch, France) a été mélangé à la solution pendant 24 h à 5 0 degrés, et le produit a subi une dialyse de 48 h à 4 degrés (seuil de 500-1000 Da, Biotech CE Tubing , Spectra/Por@, Fisher Scientific, Illkirch, France). Pour la dépolymérisation acide, la résine Amberlite" FPC23H (équivalent 10mL, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) a été mélangée à la solution pendant 24 h à 80 degrés, et le produit a été neutralisé avec NaOH (0,1 et 1 M) avant de subir 48 h dialyse à 4 degrés (seuil de 500-100 Da, Biotech CE Tubing, Spectra/Por", Fisher Scientific, Illkirch, France).bienfaits de la salsa cistancheCes deux procédures ont conduit à des fractions d'oligosaccharides appelées DEP-HD PP-UE et DEP-AD PP-UE pour H2OZ et la procédure de résine acide, respectivement.
Toutes les fractions ont été lyophilisées (Alpha 1-4LSC, Martin Christ Gefriertrocknungsanla-gen GmbH, Osterode am Harz, Allemagne) et stockées à 4 degrés avant analyse. Caractérisation de ces fractions : distribution du poids moléculaire des polysaccharides par chromatographie d'exclusion stérique haute pression (HPSEC, UHPLC Ultimate 300, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), composition biochimique, composition des monosaccharides par chromatographie échangeuse d'anions haute performance avec ampérométrique pulsé détection (HPAEC-PAD, Dionex" ICS-5000* DC, Thermo Fisher Scientific, Illkirch, France) et spectrométrie de masse à temps de vol avec ionisation par désorption laser assistée par matrice (MALDI-TOF, Bruker, Billerica, Waltham, MA , États-Unis) ont également été menées dans une étude précédente [36].
4.3.Culture cellulaire
Des échantillons de fibroblastes dermiques humains ont été fournis par "Laboratoire Interactions Ep-itheliums Neurones" (LIEN, EA 4685), Brest, France. Des échantillons de derme humain ont été obtenus à partir de biopsies cutanées de donneurs sains subissant une chirurgie d'abdominoplastie. L'étude a été menée conformément à la Déclaration d'Helsinki, et tous les patients ont signé un formulaire d'accord de consentement éclairé. Collectes d'échantillons adhérentes au comité d'agrément local ("Comité de protection des personnes" Ouest VI) et référencées sous DC 2016-2833.
Des fibroblastes dermiques humains normaux (NHDF) ont été cultivés dans du milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM, Lonza, Bâle, Suisse) avec 10 % (v/v) de sérum bovin fœtal (FBS, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, France ), une solution antibiotique à 1 % (v/v)(Pénicilline, Streptomycine 10,000 U/mL, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, France) et un antifongique à 1 % (v/v)(Fungizone, amphotéricine B, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, France), dans un incubateur à température contrôlée avec 5 % de CO2 à 37 degrés (Forma Steri-Cyclei160, Thermo Fisher Scientific Langenselbold, Allemagne). Les cellules ont été sous-cultivées par trypsinisation (0,05 %) et solution d'EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique) ((Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, France) après avoir atteint la confluence. Toutes les expériences ont été réalisées entre les 3e et 8e passages.
Les cellules ont été ensemencées sur des 96-microplaques à puits à une densité de 400 cellules/puits pour les dosages WST-1 et LDH (lactate déshydrogénase) sur des 12-plaques à puits, à une densité de 5{{8 }} cellules/puits pour la coloration rouge sirius et bleu Alcian et le dosage RT-qPCR, et sur des plaques 6-puits à une densité de 200 000 cellules/puits pour les dosages ELISA et Western blot.
Dans toutes les expériences, après avoir atteint 80 % de confluence, les cellules ont été incubées dans du DMEM avec 2 % de FBS en l'absence ou en présence des fractions poly- et oligosaccharidiques pendant 48 h à 50 et 1 000 ug/mL.
4.4.Test de prolifération cellulaire WST-1
Le WST-1, in vitro, le dosage est basé sur la conversion du sel de tétrazolium WST-1 (4-[3-(4-lodophényl){{5 }}(4-nitrophényl)-2H-5-tétrazolio]-1,3-disulfonate de benzène) en formazan (colorant orange) par des déshydrogénases mitochondriales cellulaires. Le changement de couleur est directement proportionnel à la viabilité et à la prolifération des cellules dans la culture.
Après 48 h d'incubation, le milieu a été retiré et 100 uL de réactif WST-1 (kit de prolifération cellulaire WST-1, Roche Diagnostics, Meylan, France ; dilution 1:40 dans du DMEM avec 2 % de FBS) ont été ajouté dans chaque puits. Après 45 minutes d'incubation à 37 degrés avec 5 % de CO2, l'absorbance a été mesurée à 450 contre 630 nm avec un lecteur de microplaques (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlande). 4.5.Test de cytotoxicité LDH
Le test de cytotoxicité LDH est basé sur la mesure de la lactate déshydrogénase (LDH), qui est une enzyme cytosolique stable qui est libérée lors de la lyse cellulaire. La LDH libérée dans les surnageants de culture est mesurée via la conversion d'un sel de tétrazolium (violet d'iodonitrotétrazolium) en produit de formazan rouge.dosage de cistanche tubulosa redditLa quantité de formazan rouge mesurée est proportionnelle au nombre de cellules lysées.
Le dosage LDH (CytoTox96@, Promega, Madison, WI, USA) a été effectué conformément aux instructions du fournisseur. Le contrôle positif (libération maximale de LDH) a été effectué en ajoutant 10 uL de solution de lyse 10 × (Triton X-100 à 0,8 %) pendant 45 minutes avant d'ajouter le réactif CytoTox969. Après incubation, 50 μL de surnageant de culture cellulaire ont été transférés sur une nouvelle microplaque 96-puits （non stérile）. Ensuite, 50 μL de réactif CytoTox96 degré ont été ajoutés. La microplaque a été incubée pendant 30 minutes à température ambiante dans l'obscurité. Ensuite, la réaction a été stoppée par l'ajout de 50 μL de "Stop solution". La libération de LDH a été mesurée par quantification d'absorbance avec un lecteur de microplaques à 490 nm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlande).
4.6.Alcian Blue Coloration pour la quantification des glycosaminoglycanes
La coloration au bleu alcian est une méthode de coloration qui permet de quantifier deux types de glycosaminoglycanes (GAG) : sulfatés (héparane sulfate, kératane sulfate, chondroïtine sulfate et dermatane sulfate) et non sulfatés (acide hyaluronique). Une solution de bleu alcian à pH 1 colore les GAG sulfatés, tandis qu'une solution à pH 2,5 colore les GAG non sulfatés.
A la fin de l'incubation, le milieu de culture a été retiré, et les cellules ont été rincées deux fois avec du PBS 1X (Fisher Scientific, Illkirch, Irance). Ensuite, les cellules ont été rincées pendant 5 min avec 0.1N HCl(pH1, Fisher Scientific, Illkirch, France) ou avec de l'acide acétique 3M (pH2.5, Fisher Scientific, Illkirch, France) afin de diminuer le pH et révèlent respectivement des glycosaminoglycanes sulfatés et non sulfatés. Ensuite, les cellules ont été colorées avec 1% de bleu Alcian (8GX, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) dans une solution HC10.1N (pH1) ou dans une solution d'acide acétique à 3% (pH2,5) pendant 30 min. Les cellules ont été rincées deux fois à l'eau du robinet pendant 5 min, séchées sous la hotte et rincées à l'eau distillée pendant 5 min. Ensuite, le colorant lié a été solubilisé avec une solution de chlorhydrate de guanidine 6M (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) pendant 5 min sous agitation à température ambiante. La solution colorée a été transférée dans une nouvelle microplaque 96-puits et la lecture de l'absorbance a été effectuée à 600 nm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlande).
4.7. Coloration rouge Sirius pour la quantification du collagène total
La procédure de coloration Red Sirius permet de quantifier le collagène total. Le rouge Picrosirius, un colorant anionique linéaire fort comprenant six groupes sulfonate, s'associe le long des fibres de collagène cationique.
Après incubation, le milieu de culture a été retiré et les cellules ont été rincées deux fois avec du PBS 1X (Fisher Scientific, Illkirch, France). Ensuite, 1 ml de solution de Bouin Gigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) a été ajouté dans chaque puits et les cellules ont été colorées pendant 1 h à température ambiante. Ensuite, les cellules ont été rincées deux fois avec de l'eau distillée et séchées sous la hotte. Les cellules ont été colorées avec 1 ml de solution Red Sirius (Sirius Red 80 dans une solution aqueuse saturée d'acide picrique, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) pendant 1 h. Après coloration, la solution a été retirée et les cellules ont été rincées successivement avec de l'eau distillée et HC10.01N pour éliminer le colorant non lié. Le colorant lié a été solubilisé avec NaOH0.1N pendant 30 min. La solution colorée a été transférée dans une nouvelle microplaque à puits 96- et une lecture d'absorbance a été effectuée à 550 nm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlande). 4.8.Collagène de type I et MMP-1 ELISA
Après incubation, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS 1X (Fisher Scientific, Illkirch, France). Les fibroblastes ont été lysés dans un tampon RIPA (test de radioimmunoprécipitation) (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) additionné d'un cocktail d'inhibiteurs de protéase (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) à 4 degrés pendant 1 h. Les cellules ont été grattées et les échantillons ont été vortexés pendant 30 min et centrifugés (12,00xg pendant 30 min à 4 degrés). Les surnageants contenant des protéines intracellulaires ont été collectés, puis stockés à -80 degré jusqu'à l'analyse pour la détermination des protéines et l'analyse Western blot. La concentration en protéines a été déterminée par le test Pierce BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) en utilisant l'albumine de sérum bovin (BSA) comme standard.
Le surnageant de culture cellulaire a été collecté et centrifugé pour éliminer les débris cellulaires (200 × g pendant 10 minutes à 4 degrés) et stocké à -80 degrés jusqu'à l'analyse.
Les mesures de collagène de type I et de MMP-1 ont été évaluées dans des milieux de culture avec des kits Abcam (ab210966 Human Pro-Collagen I alpha 1 SimpleStep ELISA Kit et ab215083 Human MMP1 SimpleStep ELISA Kit, Cambridge, MA, USA) conformément aux instructions du fabricant. . L'absorbance a été mesurée à 450 nm avec un lecteur de microplaques (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlande). Les résultats ont été normalisés avec les concentrations de protéines cellulaires préalablement déterminées. 4.9. Western BlotL'extraction des échantillons de protéines a été décrite dans la section précédente 4.8. Des échantillons de protéines avec du tampon Laemmli (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France) ont été bouillis 5 min à 95 degrés puis centrifugés à 16,000×g pendant 1 min. Des quantités égales de protéines (10 ug) ont été chargées dans des puits de gel TGX Stain-Free à 7,5 % ou 4-15 % (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France), ainsi que Precision Plus Protein "Unstained Protein standard (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France) Le gel a été exécuté à 200 V pendant 30 min (PowerPac"Basic avec Mini-PROTEAN Tetra System, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France). Le transfert de protéines du gel vers une mini membrane PVDF (fluorure de polyvinylidène) (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France) a été réalisé avec un système de transfert Trans-Blot Turbo (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France ). La membrane a été bloquée avec 3 % de BSA Gigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) ou 5 % de lait écrémé en poudre dans du TBST (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France) pendant 1 h à température ambiante et lavé avec du TBST. La membrane a été sondée avec du collagène de type I (Novotec, Reuver, Pays-Bas), du collagène de type III (Novotec, Reuver, Pays-Bas), du MMP-1 (EnoGene, New York, NY, États-Unis) ou du TIMP{{43 }}(RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA) anticorps ; ensuite, il a été lavé plusieurs fois avec du TBST et incubé pendant 1h à température ambiante avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase (Jackson ImmunoResearch, Ely, UK). appliqué pendant 5 min sur les membranes et la révélation a été réalisée à l'aide de ChemiDoc XRS plus Molecular Imager (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France). Le niveau de protéines a été quantifié à l'aide du logiciel ImageLab v6.01.1.
4.10.Zymographie
Une zymographie a été réalisée pour analyser la forme active de la collagénase MMP-1 selon Inanc et al. (2017) méthode adaptée [52].
Des gels SDS-PAGE (10 % de polyacrylamide, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France) ont été copolymérisés avec 1 mg/mL de collagène de type I queue de rat Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, France). les échantillons (5 ug) ont été mélangés avec un tampon d'échantillon non réducteur (Tris HCl 62,5 mM pH 6,8, 20 % de glycérol, 4 % de SDS, 0,01 % de bleu de bromophénol), centrifugés 1 minute à 4 degrés, chargés dans des puits du gel, avec Precision Plus Protein "All Blue Standards (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France), puis soumis à une électrophorèse à 110 V à 4 degrés pendant 2 h. Le gel a été lavé deux fois dans du Triton X à 2,5 %{{26 }} (v/v) pendant 15 min à chaque fois afin d'éliminer le SDS. Ensuite, le gel a été incubé dans du tampon de développement Zymogram (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France) pendant 48 h à 37 degrés. Après incubation , le gel a été coloré pendant 1 h avec une solution à 0,5 % de bleu de Coomassie R-250 (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France) (p/v), puis décoloré dans 40 % de méthanol et 10 % d'acide acétique glacial la solution (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France). L'activité MMP-1 a été détectée sous la forme d'une bande claire sur un fond de gel coloré au bleu de Coomassie. La quantification a été effectuée sur ChemiDoc XRS plus Molecular Imager (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France) avec le logiciel Image Lab version 6.01.1 (Bio-Rad). 4.11. Isolement de l'ARN et RT-PCR en temps réel
Après 48 h d'incubation, l'ARN total a été extrait au TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) et au chloroforme (Acros Organics,Fisher Scientific, Illkirch, France), précipité à l'isopropanol (Fisher Scientific, Illkirch, France), lavé à l'éthanol 75 cent , séché sous hotte avant remise en suspension dans de l'eau traitée au DEPC (diéthylpyrocarbonate) (Fisher Scientific, IIlkirch, France). La quantité d'ARN et le niveau de pureté (entre 1,8 et 2.0) ont été estimés avec une mesure d'absorbance sur un lecteur de microplaques (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlande) à 260 et 280 nm à l'aide d'une plaque Drop TM (Thermo Fisher scientifique, Waltham, MA, États-Unis).
Un microgramme d'ARN total a été traité avec DNaseI (iScript Dnase Master Mix, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France) pendant 5 min à 25 degrés pour éliminer les contaminants de l'ADN. L'enzyme a été inactivée pendant 5 min à 75 degrés.
La transcription inverse a été réalisée sur 1 ug d'ARN total, préalablement traité avec de la DNase I, en utilisant iScript Reverse Transcription (RT) Supermix (Bio-rad, Marnes-La-Coquette, France). Les étapes suivies pour la synthèse d'ADNc étaient de 5 min à 25 degrés , 20 min à 46 degrés et 1 min à 95 degrés.
Des témoins non-matrice ont été inclus dans les expériences de PCR. La qPCR a été réalisée dans des plaques 96-puits pour un volume total de 20 μL contenant 1 μL de 1∶15 échantillons d'ADNc dilués de RT, 1 μL d'amorce (voir tableau 4, Bio-Rad, Marnes -La-Coquette, France), 10 μL d'iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France) et 8 μL d'eau sans nucléase. Les conditions d'amplification étaient de 2 min à 95 degrés suivis de 40 cycles de 5 s à 95 degrés et 30 s à 60 degrés, et se terminent par 5 s à 95 degrés et 5 s à 65 degrés avant le protocole pour la courbe de fusion : augmentation de 0,5 degré de 65 degrés à 95 degrés. Les expériences de PCR ont été réalisées sur le système CFX 96 (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France) et les résultats ont été collectés à partir du logiciel Bio-Rad CFX Manager v3.1 (Marnes-La-Coquette, France). Les quantités d'ARNm ont été normalisées par rapport à l'ARNm de RPL13A et l'analyse de l'expression relative des gènes a été calculée à l'aide de la méthode 2-AACt.
4.12. Analyses statistiques
Toutes les valeurs ont été exprimées comme la moyenne de n expérience ± erreur standard (SE).
Des analyses statistiques ont été effectuées à l'aide d'Addinsoft (2020). L'évaluation de la distribution normale des données a été évaluée à l'aide du test de Shapiro-Wilk. Les différences significatives entre les échantillons témoins et expérimentaux ont été analysées par le test t de Student (indépendant, bilatéral), lorsqu'une distribution normale s'est produite, et par le test de Mann-Whitney, lorsque la distribution normale a été rejetée. Les différences significatives par rapport au contrôle selon le test statistique sont indiquées par des astérisques(*p<><0.01 and=""><0.001). differences="" that="" are="" not="" statistically="" significant="" are="" named="" "ns"="" in="" the="" text="" and="" are="" characterized="" by="" the="" absence="" of="" asterisks="" on="" the="">
5. Conclusions
Ce travail démontre que les fractions poly- et oligosaccharidiques, enrichies en ulvanes, récupérées après la nouvelle technologie verte EAE de l'algue verte Uloa sp., influencent la prolifération des fibroblastes, la synthèse des protéines ECM, le renouvellement de la matrice et le remodelage. Une application potentielle dans les stratégies cosmétiques anti-âge pourrait émerger puisque le vieillissement cutané se caractérise par une diminution de la synthèse de collagène. Ainsi, le renouvellement de la matrice cutanée est bénéfique dans ce contexte. Ainsi, les ulvanes, issues d'Ulva sp. fractions obtenues après EAE, sont biologiquement actives sur le métabolisme des fibroblastes cutanés dermiques humains. Les auteurs suggèrent que cette activité est fonction de l'abondance d'ulvanes, de la composition en sulfate et du poids moléculaire des fractions. Les auteurs supposent que ces molécules sulfatées riches en rhamnose correspondent à des molécules de signalisation, qui sont reconnues par les sites de lectine des fibroblastes membranaires et stimulent par la suite leur activité métabolique tant du point de vue anabolique que catabolique. Cependant, d'autres investigations sont nécessaires pour évaluer en profondeur le mécanisme moléculaire activé par le poly- et oligosaccharide Ulou sp. fractions au niveau des facteurs de transcription, la capacité de pénétration des ulvanes de haut et bas poids moléculaire dans des modèles de peau 3D ou d'explants de peau ex vivo, et de confirmer ces résultats de modulation de l'ECM avec des fractions dérivées d'Uloa EAE dans ces modèles pour une cible anti-âge.
Cet article est extrait de Mar. Drugs 2021, 19, 156. https://doi.org/10.3390/md19030156 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs
