Étude sur la méthode de détermination de la teneur en glycoside pinéal et en glycoside ergostérol dans Cistanche Tubulosa

Cistanche tubulosa est une tige charnue sèche aux feuilles écailleuses appartenant au genre Cistanche de la famille des Ledaceae. Il est de nature chaude, au goût sucré et salé et appartient aux méridiens des reins et du gros intestin. Il a des effets traditionnels tels que tonifier le yang des reins, nourrir l'essence et le sang, humidifier les intestins et favoriser les selles, et retarder le vieillissement. Il est connu sous le nom de « Ginseng du désert ». À partir de l'édition 2010 de la Pharmacopée de la République populaire de Chine, Cistanche tubulosa (Schrenk) R. Wight a été ajoutée comme l'une des plantes basales statutaires de Cistanche et répertoriée aux côtés de C. deserticola.

La Cistanche tubulosa est principalement produite le long de la limite sud du bassin du Tarim, dans la région autonome ouïgoure du Xinjiang, et pousse de manière parasitaire sur les racines des plantes Tamarix. C'est actuellement la principale source de matières médicinales Cistanche tubulosa sur le marché chinois, avec une production annuelle représentant plus de 60 %. En raison de la raréfaction croissante des ressources sauvages, elle a été classée plante protégée de deuxième classe dans la liste nationale des plantes sauvages protégées (édition 2021).

La recherche pharmacologique moderne a montré que la substance pharmacologique principale de Cistanche tubulosa est basée sur des glycosides phényléthanoïdes (PhG), parmi lesquels l'échinacoside (C35H46O20) et l'actéoside/verbascoside (C29H36O15) ont la teneur la plus élevée et l'activité la plus forte, et sont explicitement désignés comme composants caractéristiques pour le contrôle de qualité des matières médicinales de Cistanche tubulosa par la pharmacopée chinoise. Selon l'édition 2020 de la Pharmacopée chinoise, la quantité totale d'échinacroside et de verbascoside dans le produit séché de Cistanche tubulosa ne doit pas être inférieure à 1,5 %, ce qui est bien supérieur à la norme de 0,30 % pour le Cistanche tubulosa du désert. Par conséquent, l’établissement de méthodes de détermination de la teneur précises, efficaces et reproductibles revêt une grande importance pour le contrôle de la qualité, l’évaluation de l’origine, l’optimisation de la plantation et le développement de produits à base de matières médicinales Cistanche tubulosa.

L'échinoside, principal composant chimique du Cistanche tubulosa

Actéoside, le principal composant chimique de Cistanche tubulosa

Caractéristiques chimiques du glycoside de chrysanthème pomme de pin et du glycoside d'ergotamine

structure chimique

Le glycoside de pomme de pin et le glycoside d'ergostérol sont tous deux des glycosides phényléthanoïdes, dont le squelette de base est composé d'un noyau phényléthanoïde relié par des liaisons glycosidiques à des groupes sucre (généralement glucose et rhamnose), et des groupes substitués tels que des groupes caféoyle sont introduits en position hydroxyle phénolique. La formule moléculaire de l'échinacoside est C35H46O20, avec un poids moléculaire relatif de 786,72. Sa structure contient un groupe caféoyle, un groupe glucose et un groupe rhamnose. La formule moléculaire du glycoside d'ergostérol (verbascoside) est C29H36O15, avec un poids moléculaire relatif de 624,59. Sa structure est similaire à celle du pinéaloside, mais il lui manque du rhamnose et certaines substitutions caféoyles. Les deux sont facilement solubles dans les solvants polaires tels que le méthanol, l’éthanol et l’eau, et ont une absorption caractéristique dans la région ultraviolette (longueur d’onde d’absorption maximale autour de 330 nm), ce qui constitue une base théorique pour la détection HPLC-UV.

Activité pharmacologique

Le glycoside de chrysanthème de pomme de pin et le glycoside d'ergostérol ont un large éventail d'activités pharmacologiques : (1) effet antioxydant - en éliminant les anions superoxydes (O2 · -), les radicaux hydroxyles (· OH) et le peroxyde d'hydrogène (H2O2), en activant la voie de signalisation Nrf2/ARE et en régulant positivement l'activité des enzymes antioxydantes telles que la SOD et le GSH Px ; (2) Effet neuroprotecteur – favorisant l'expression de facteurs neurotrophiques tels que le GDNF, qui a un effet améliorant sur les modèles de la maladie d'Alzheimer et de la maladie de Parkinson ; (3) Effets de type hormonal – favorisent l’expression des enzymes liées à la synthèse de la testostérone et améliorent la fonction de reproduction ; (4) Effet hépatoprotecteur – réduisant les lésions hépatiques alcooliques et le stress oxydatif ; (5) Effet antitumoral - induit l'apoptose des cellules cancéreuses de l'œsophage par des voies dépendantes des mitochondries. Les activités ci-dessus en font des indicateurs irremplaçables pour l’évaluation de la qualité de Cistanche tubulosa.

Effets de la cistanche-antitumorale

Présentation des méthodes de détermination du contenu

À l'heure actuelle, les méthodes permettant de déterminer la teneur en glycoside pinéal et en glycoside d'ergostérol dans Cistanche tubulosa comprennent principalement la chromatographie liquide haute performance (HPLC), la chromatographie liquide ultra haute performance (UPLC), la numérisation d'images par chromatographie sur couche mince (TLC ImageJ) et la spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide (LC-MS/MS). Parmi elles, la méthode HPLC a été adoptée comme méthode de détermination légale par la Pharmacopée chinoise en raison de la grande popularité de son équipement, de son fonctionnement simple et de sa bonne reproductibilité, et constitue actuellement la méthode la plus largement rapportée dans la littérature. Ce qui suit se concentre sur l’établissement du système et le processus d’optimisation de la méthode HPLC.

L’influence des différentes origines et hébergeurs sur le contenu

Différences d’origine

De nombreuses études ont montré de manière constante qu'il existe des différences significatives dans la teneur en échinacroside et en ergostérol du Cistanche tubulosa de différentes régions. En prenant le Xinjiang comme exemple, la différence dans le contenu de deux composants dans des échantillons provenant d'endroits tels que le comté de Hetian Moyu, le comté de Kashgar Jiashi et la ville d'Alar peut atteindre 2 à 5 fois. D'une manière générale, la quantité totale de glycosides phényléthanoïdes dans Cistanche tubulosa produite dans la région de Hotan (en particulier les comtés de Moyu, Minfeng et Yutian) est relativement élevée, et la teneur en glycosides phényléthanoïdes dans certains échantillons de haute qualité peut atteindre 2,5 % à 5,0 %, dépassant de loin la norme de la pharmacopée de 1,5 %.

Différentes influences de l'hôte

Cistanche tubulosa parasite les racines de différentes plantes du genre Tamarix, et les espèces hôtes ont un impact significatif sur la qualité des matières médicinales. Chen et coll. (2005) ont rapporté que la teneur en acide phényléthanolique des échantillons parasités sur T. talama kanensis était généralement supérieure à celle parasitée sur T. ramosissima. De plus, il existe des différences entre les produits sauvages et cultivés. Généralement, la teneur en deux composants des produits sauvages est supérieure à celle des produits cultivés, mais les produits cultivés de haute qualité peuvent également atteindre des niveaux plus élevés en optimisant les conditions de plantation.

Différences dans les spécifications et les pièces

Les spécifications (diamètre, longueur) et les parties médicinales de Cistanche tubulosa ont également un impact sur son contenu. Des recherches ont montré que la teneur en échinacoside et en ergostérol des tiges charnues plus fines est souvent plus élevée que celle des tiges plus épaisses ; Le contenu de la partie supérieure de la tige (près de l’extrémité de l’inflorescence) est généralement plus élevé que celui de la base. Cette règle sert de référence pour la sélection des pièces lors de la récolte et de la transformation des herbes médicinales.

Introduction à d'autres méthodes de mesure

Chromatographie liquide à ultra haute performance (UPLC)

Expérience Cistanche tubulosa

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La méthode UPLC utilise une colonne de chromatographie avec une taille de particule plus petite (telle que Waters HSS T3, 1,8 μm, 100 × 2,1 mm), un débit de 0,3 mL/min, un volume d'injection de seulement 1 μL et le temps d'analyse peut être raccourci à 10-15 min (la HPLC traditionnelle nécessite 30-50 min), avec une meilleure séparation et sensibilité. Liang Jiansong et coll. (2021) ont établi une méthode UPLC pour la détermination simultanée de six glycosides phényléthanoliques, qui présente une large plage linéaire et un taux de récupération élevé, et convient au criblage rapide de grandes quantités d'échantillons.

Méthode LC-MS/MS

La méthode de spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide a une sensibilité extrêmement élevée et peut déterminer simultanément des dizaines de composants de Cistanche tubulosa, notamment l'échinacoside, le glycoside d'ergostérol, le glycoside d'isoergostérol et la guanosine A. Elle convient à la recherche en métabolomique et à l'évaluation complète de la qualité. La technologie combinée RPLC-HILIC peut même mesurer 23 composants polaires et non polaires à la fois, couvrant une plage de contenu de 5 ordres de grandeur.

Méthode HPLC de chromatographie par courants de Foucault par microextraction par solvant sous pression en ligne

Cette méthode associe l'extraction, la purification et la séparation chromatographique en ligne des échantillons, réduisant ainsi considérablement la consommation de solvants organiques et l'utilisation des échantillons. Les LOQ des trois glycosides phényléthanoliques sont respectivement de 0,50 mg/L (échinacoside), 0,25 mg/L (glycoside d'ergostérol) et 0,38 mg/L (glycoside d'isoergostérol), qui conviennent à l'analyse rapide d'échantillons précieux.

Méthode de numérisation d'images TLC

poudre d'extrait de cistanche

Sur la base du logiciel ImageJ, une analyse quantitative a été réalisée sur les valeurs de gris des taches de chromatographie sur couche mince. Les coefficients de corrélation r du glycoside de chrysanthème pinéal, de la guanosine A, du glycoside d'ergostérol et du glycoside d'isoergostérol étaient respectivement de 0,9974, 0,9931, 0,9923 et 0,9890, ce qui était cohérent avec la méthode HPLC. Cette méthode est peu coûteuse, facile à mettre en œuvre et adaptée au dépistage rapide dans les unités de base et sur le terrain.

discussion

Enjeux clés dans l’optimisation des conditions chromatographiques

La sélection de la phase mobile est cruciale dans le développement des méthodes HPLC. La comparaison de la littérature montre que : (1) le système eau-acétonitrile est susceptible de provoquer une traînée du pic de glycoside phényléthanolique, et l'ajout de 0,1 % d'acide formique ou de 1 % d'acide acétique peut améliorer considérablement la forme du pic ; (2) L'efficacité de séparation du système ternaire méthanol-acétonitrile-acide acétique est supérieure à celle du système binaire méthanol pur ou acétonitrile pur ; (3) La sélection de la longueur d'onde de détection de 330 à 334 nm peut équilibrer l'intensité d'absorption des deux composants, avec une réponse légèrement plus élevée à 334 nm et moins d'interférences de l'ergostérol à 330 nm. La température de la colonne a un impact sur le temps de rétention mais ne modifie pas de manière significative le degré de séparation, avec une plage raisonnable de 30 à 35 degrés.

Optimisation des méthodes d'extraction

La concentration du solvant, le rapport solide-liquide, la température des ultrasons et la durée affectent tous l’efficacité de l’extraction. La recherche a montré que : (1) 50 % à 80 % de méthanol ou d'éthanol peuvent extraire efficacement les deux composants glycosides, avec un taux d'extraction légèrement plus élevé de 60 % à 80 % d'éthanol ; (2) Un rapport solide-liquide de 1:30~1:50 (g/mL) est suffisant pour une extraction complète ; (3) La combinaison optimale est une température ultrasonore de 50 à 60 degrés et une durée de 40 minutes ; (4) L'extraction par ultrasons est supérieure à l'extraction par reflux, car cette dernière peut facilement conduire à la dégradation des glycosides phényléthanoliques thermosensibles.

Discussion sur la rationalité des normes de pharmacopée

La pharmacopée actuelle stipule que la quantité totale de glycosides de paéoniflorine et d'ergostérol dans Cistanche tubulosa doit être supérieure ou égale à 1,5 %. Cette norme est relativement souple : les échantillons de haute qualité du Xinjiang atteignent généralement 3 à 5 %, seuls quelques échantillons de mauvaise qualité s'approchant de la limite inférieure. Certains chercheurs suggèrent d'augmenter la norme de 2,0 % à 2,5 % pour mieux garantir la qualité des matières médicinales. De plus, la pharmacopée n'utilise que deux composants comme indicateurs, tandis que Cistanche tubulosa contient également divers glycosides phényléthanoliques actifs tels que la guanosine A, les glycosides d'isoergostérol et l'hespéridine. L’évaluation globale multi-indicateurs constitue l’orientation future du développement.

Suggestions pour la sélection de la méthode

Pour l'inspection qualité des matières médicinales générales et le contrôle qualité quotidien de la production, il est recommandé d'utiliser la méthode HPLC de la pharmacopée. La méthode est mature, les besoins en équipement sont faibles et les résultats sont hautement comparables. Pour le criblage d’échantillons à grande échelle ou l’analyse d’échantillons précieux, les méthodes UPLC ou PLME-TFC-HPLC en ligne sont plus efficaces. La méthode de classification LC-MS/MS est la méthode privilégiée pour une évaluation approfondie de la qualité et l’identification des variétés. La méthode d’imagerie TLC convient à un dépistage initial rapide au niveau local. Les chercheurs doivent faire des choix raisonnables en fonction des besoins réels.

poudre d'extrait de cistanche

Conclusion

Cet article développe systématiquement la méthode HPLC pour déterminer la teneur en échinacoside et en ergostérol de Cistanche tubulosa. Cette méthode a été validée par méthodologie multidimensionnelle et présente les caractéristiques d'une large plage linéaire (r supérieur ou égal à 0,999), d'une bonne précision (RSD<3%), high accuracy (recovery rate 95.7%~100.7%), and easy operation, fully meeting the quality control requirements of the Chinese Pharmacopoeia for Cistanche tubulosa.

Une analyse complète montre que : (1) la teneur en glycoside pinéal de Cistanche tubulosa est généralement 3 à 8 fois supérieure à celle du glycoside d'ergostérol, et la quantité totale des deux varie en fonction du lieu d'origine, de l'hôte, de la taille et de l'emplacement ; (2) La quantité totale d'acide phényléthanolique dans des échantillons de haute qualité provenant de Hotan, Xinjiang, peut atteindre 2 à 3 fois ou plus la norme de la pharmacopée ; (3) Les nouvelles technologies telles que UPLC et LC-MS/MS fournissent des outils puissants pour la détermination synchrone multi-composants et l'évaluation approfondie de la qualité.

Les recherches futures devraient se concentrer sur : (1) l’établissement d’un système d’évaluation de la qualité à index multiples couvrant davantage de glycosides phényléthanoïdes ; (2) étudier de manière approfondie l'impact global de l'environnement de plantation, de la période de récolte des hôtes et de la méthode de traitement sur le contenu ; (3) promouvoir la normalisation de l'ensemble de la chaîne industrielle du Guanhua Cistanche, depuis les herbes médicinales jusqu'aux aliments santé et aux matières premières cosmétiques.

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