Le lecteur d'ARN M6 A YTHDF2 contrôle l'immunité antitumorale et antivirale des cellules NK, partie 6

Modèle de mélanome métastatique et défi MCMV

Des cellules B16F10 (105) ont été injectées par voie intraveineuse à des souris. 14 jours après l'injection, les souris ont été euthanasiées pour analyse post-mortem. Les nodules métastatiques dans les poumons ont été analysés macroscopiquement et comptés. La lignée cellulaire B16F10 a été fournie par Hua Yu (City of Hope, Los Angeles, Californie). Les souris Ythdf2ΔNK et Ythdf2WT ont été infectées par une injection ip de la souche Smith MCMV (2, 5 × 104 PFU), achetée auprès de l'American Type Culture Collection (VR -1399). Des échantillons de sang périphérique ont été obtenus par ponction sous-mandibulaire aux jours 0, 4 et 7 après l'infection.

Les nodules de métastases pulmonaires font référence à des nodules formés par des cellules tumorales malignes provenant d'autres sites qui migrent vers les poumons par le sang ou le système lymphatique. Pour de nombreux patients, il s’agit d’une manifestation courante du cancer du poumon.

Cependant, bien que les nodules métastasiques pulmonaires constituent une menace pour la santé physique des patients, il n’existe pas de relation directe entre eux et la mémoire. Par conséquent, nous devons faire face activement aux défis du cancer du poumon et des nodules métastasiques pulmonaires, et ne pas laisser les émotions négatives et l’anxiété affecter notre santé physique et mentale.

En même temps, nous pouvons maintenir et améliorer la mémoire grâce à certaines méthodes positives. Par exemple, effectuez un entraînement de mémoire, comme des calculs mathématiques, lire, écouter de la musique, jouer à des jeux, etc. De plus, adhérer à de bonnes habitudes de vie, comme faire de l'exercice régulièrement, dormir suffisamment, manger sainement, etc., peut également améliorer notre mémoire.

Le plus important est de garder une attitude positive. Quelles que soient les difficultés auxquelles vous faites face, vous devez croire en votre force et en la flexibilité de votre système nerveux, et grâce à des ajustements et des réponses positifs, vous finirez par réussir à surmonter les difficultés.

Bref, bien que les nodules métastatiques dans les poumons constituent une menace pour la santé physique, ils ne sont pas directement liés à la mémoire. Nous devons y faire face de manière positive et entretenir et améliorer notre mémoire en ajustant notre mode de vie et en maintenant une bonne attitude. On voit que nous devons améliorer la mémoire, et Cistanche deserticola peut améliorer considérablement la mémoire, car Cistanche deserticola peut également réguler l'équilibre des neurotransmetteurs, comme en augmentant les niveaux d'acétylcholine et de facteurs de croissance. Ces substances sont très importantes pour la mémoire et l’apprentissage. En outre, Cistanche deserticola peut également améliorer la circulation sanguine et favoriser l'apport d'oxygène, ce qui peut garantir que le cerveau reçoive suffisamment de nutriments et d'énergie, améliorant ainsi la vitalité et l'endurance du cerveau. On voit que nous devons améliorer la mémoire, et Cistanche deserticola peut améliorer considérablement la mémoire, car Cistanche deserticola peut également réguler l'équilibre des neurotransmetteurs, comme en augmentant les niveaux d'acétylcholine et de facteurs de croissance. Ces substances sont très importantes pour la mémoire et l’apprentissage. En outre, Cistanche deserticola peut également améliorer la circulation sanguine et favoriser l'apport d'oxygène, ce qui peut garantir que le cerveau reçoive suffisamment de nutriments et d'énergie, améliorant ainsi la vitalité et l'endurance du cerveau.

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Pour mesurer les charges virales dans le sang périphérique, la rate et le foie, l'ADN a été isolé à l'aide d'un kit de sang et de tissus QIAGEN DNeasy pour l'analyse qPCR. Les amorces suivantes ont été utilisées : MCMV-IE1, 59-AGCCACCAACATTGACCACGCAC-39 (avant) et MCMVIE1, ​​59-GCCCCAACCAGGACACACAACTC-39 (inverse).

Traitement in vivo de souris avec IL-15

Pour le traitement in vivo de souris avec IL -15, les souris Ythdf2ΔNK et Ythdf2WT ont reçu une injection de 2 µg d'IL humaine recombinante ip -15 (numéro de catalogue 745101 ; National Cancer Institute) pendant 5 jours. Les souris traitées et témoins ont ensuite été euthanasiées pour une analyse cytométrique en flux.

Cytométrie en flux

Des suspensions unicellulaires ont été préparées à partir de BM, de sang, de rate, de foie et de poumons de souris Ythdf2ΔNK et Ythdf2WT, comme décrit précédemment (Wang et al., 2018b). L'analyse par cytométrie en flux et le tri des cellules ont été effectués respectivement sur un LSRFortessa X-20 et un cytomètre en flux FACSAriaFusion (BD Biosciences).

Les données ont été analysées à l'aide du logiciel NovoExpress (Agilent Technologies).

Les anticorps suivants marqués par un colorant fluorescent de BD Biosciences, BioLegend, Invitrogen ou Cell Signaling Technology ont été utilisés : CD3ε (145-2C11), CD19 (1D3), Gr-1 (RB6-8C5 ),TER-119 (TER-119), CD11c (N418), CD4 (GK1.5), CD8 (53-6.7),CD122 (5H4), CD132 (TUGm2), NK1.1 (PK136), CD11b (M1/70), CD27 (LG.3A10), CD117 (2B8), CD127 (SB/199), CD135 (A2F10.1), KLRG1 (2F1), CD45 ({{46 }}F11), CD45.1 (A20), CD45.2 (104), IFN- (XMG1.2), 2B4 (m2B4), granzyme B (QA16A02), perforine (S16009A), Ly49H (3D10), Ly49D ( 4e5), CD69 (H1.2F3), CD226(TX42.1), NKG2D (CX5), NKG2A (16A11), NKp46 (29A1.4), TIGIT(1G9), PD-1 (J43), annexine V, Ki67 (b56), Tbet (4b10) et Eomes (WD1928), phospho-p44/42 Erk1/2 (Thr202/Tyr204, #9101), phospho-Akt (Ser473, #5315), protéine ribosomale phospho-S6 ,phospho-Stat3 (Tyr705, #9145) et phospho-Stat5 (Tyr694,#9539).

Pour l'évaluation de la prolifération des cellules NK, les cellules ont été marquées avec 5 µM de CTV (Invitrogen) selon le protocole du fabricant avant de les transférer chez des souris receveuses. La coloration intracellulaire de Ki67, Tbet et Eomes a été réalisée par fixation et perméabilisation avec le kit de coloration Foxp3/Transcription Factor (eBioscience).

Pour la détection des protéines phosphorylées, les cellules NK spléniques purifiées ont été prétraitées avec de l'IL humaine recombinante -15 (50 ng/ml) pendant 1 h, puis fixées avec du Phosflow Fix Buffer I, suivies d'une perméabilisation avec du Phosflow Perm Buffer III (BD Biosciences) et d'une coloration avec anticorps.

Transfert de cellules adoptif

Pour évaluer l'effet du déficit en Ythdf2 sur la maturation des cellules NK, un mélange de 5 × 106 cellules BM dans un rapport 1: 1 provenant de souris CD45.1 ou Ythdf2ΔNK CD45.2 a été cotransféré dans des souris Rag2−/−Il2rg−/−. La reconstitution des receveurs a été évaluée par cytométrie en flux 8 semaines après la transplantation.

Pour les expériences de prolifération homéostatique induite par la lymphopénie, un nombre égal de cellules spléniques purifiées provenant de souris CD45.1 ou Ythdf2ΔNK CD45.2 ont été cotransférées dans des souris Rag2−/−Il2rg−/−, suivies d'une évaluation des pourcentages relatifs de cellules NK WT et Ythdf2ΔNK transférées dans la rate. des receveurs Rag2−/−Il2rg−/− par cytométrie en flux aux moments indiqués.

Pour le modèle de mélanome métastatique, 106 cellules NK expansées par IL-2 provenant de souris Ythdf2ΔNK ou Ythdf2WT ont été injectées par voie intraveineuse à des souris Rag2−/−Il2rg−/−. Un jour plus tard, des cellules B16F10 (105) ont été injectées par voie intraveineuse à des souris. 14 jours après l'injection, les souris ont été euthanasiées pour une analyse post-mortem. Dans certaines expériences, les cellules ont été marquées avec du CTV (5 µM, Invitrogen) pour suivre la prolifération cellulaire avant le transfert.

Test de trafic in vivo

Pour détecter le trafic de cellules NK de la BM vers le sang périphérique, 1 µg d'anticorps anti-CD45 marqué par APC iv a été injecté à des souris C57BL/6. Deux minutes après l'injection de l'anticorps, les souris ont été euthanasiées immédiatement et les cellules BM ont été collectées pour une cytométrie en flux après que les cellules aient été colorées avec les anticorps CD3 et NK1.1. Les cellules NK parenchymateuses ont été identifiées par l'absence de coloration CD45, tandis que les cellules NK sinusoïdales ont été identifiées par la présence d'un marquage CD45. Par conséquent, le rapport entre les cellules NK dans les sinusoïdes (CD 45+) et celles dans les régions parenchymateuses (CD45−) indique le trafic de cellules NK du BM vers le sang périphérique dans un état d'équilibre.

RT-qPCR en temps réel et immunoblot

L'ARN a été isolé à l'aide d'un kit RNeasy Mini (QIAGEN), puis transcrit de manière inverse en ADNc avec le kit de réactifs PrimeScript RT avec gDNA Eraser (Takara Bio) conformément aux instructions du fabricant. Les niveaux d'expression de l'ARNm ont été analysés à l'aide du SYBRGreen PCR Master Mix et d'un système QuantStudio 12K Flex Real-TimePCR (tous deux de Thermo Fisher Scientific). Les séquences d'amorces sont répertoriées dans le tableau S1.

L'immunotransfert a été réalisé selon les procédures standard, comme décrit précédemment (Denget al., 2015 ; Yu et al., 2006). Les anticorps suivants ont été utilisés : METTL3 (numéro de catalogue 15073-1-AP ; Proteintech), METTL14 (numéro de catalogue 26158-1-AP ; Proteintech), YTHDF1 (numéro de catalogue 17479-1-AP ; Proteintech), YTHDF2 (cat. n° RN123PW ; MBL), YTHDF3 (cat. n°25537-1-AP ; Proteintech), ALKBH5 (cat. n° ab195377 ; Abcam), FTO (cat. n° ab124892 ; Abcam), MDM2 (n° de cat. 33-7100 ; Invitrogen), TDP-43 (n° de cat. PA5-29949 ; Invitrogen) et -actin (n° de cat. {{20 }}Ig ; Proteintech).

test d'inactivation du siRNA

IL-2–expanded NK cells were transfected with Accell mouse Tardbp siRNA (cat. no. E-040078-00-0005; Dharmacon) or Mdm2 siRNA (cat. no. E-041098-00-0005; Dharmacon) using Accell delivery media (Dharmacon) according to the manufacturer's instructions in the presence of IL-15 (50 ng/ml). The Accell eGFP control pool was used as siRNA control. The transfection efficiency was >90 % tel que mesuré par cytométrie en flux. L’efficacité de Geneknockdown a été déterminée par qPCR et immunoblot. Trois jours après la transfection, l'apoptose cellulaire et la prolifération ont été analysées par cytométrie en flux comme décrit ci-dessus.

Test rapporteur luciférase

La région promotrice Ythdf2 allant de –2,000 bp à +100 bp du TSS a été amplifiée à partir de cellules NK murines et clonée dans apGL4-Basic Luciferase Reporter Vector (Promega) pour générer apGL{ {5}}Plasmide rapporteur Ythdf2. Les cellules HEK293T achetées auprès de l'ATCC ont été cotransfectées avec les plasmides rapporteurs pGL 4- Ythdf2 ainsi que des plasmides de surexpression STAT5a ou STAT5b ou un vecteur vide, ainsi qu'un plasmide rapporteur pRL-TK Renilla (Promega) pour la normalisation de l'efficacité de la transfection. Les cellules ont été récoltées pour la lyse 24 h après la transfection et l'activité de la luciférase a été quantifiée par fluorimétrie avec le système Dual-Luciferase (Promega). Les séquences d'amorces pour le clonage du promoteur Ythdf2 et des plasmides de surexpression STAT5a et STAT5b sont répertoriées dans le tableau S1.

Tests de puces

Les tests ChIP ont été effectués à l'aide d'un kit Pierce Magnetic ChIP (cat. n° 26157 ; Thermo Fisher Scientific) conformément aux instructions du fabricant. En bref, une quantité égale d'ananti-anti-phospho-Stat5 (Tyr694, n° de catalogue 9351 ; Cell Signaling Technologies) ou d'IgG de lapin normal témoin correspondant a été utilisée séparément pour précipiter les complexes ADN-protéine réticulés dérivés de 5 × 106 cellules NK primaires de souris purifiées qui ont été prétraitées avec de l'IL -15 (50 ng/ml) pendant 1 h. Suite à l'inversion de la réticulation, l'ADN immunoprécipité par l'anticorps indiqué a été testé par qPCR. Les séquences de toutes les amorces sont répertoriées dans le tableau S1.

Test de cytotoxicité ex vivo

La cytotoxicité ex vivo des cellules NK a été évaluée par des tests standard de libération du 51Cr. Les lignées cellulaires de lymphome de souris RMA-S (classe CMH Idéficiente) et RMA (classe CMH I suffisante), un don d'André Veillette (Université McGill, Montréal, Canada), ont été utilisées comme cellules cibles. Les souris ont été traitées par injection ip d'acide polyinosinique: polycytidylique [poly (I: C); 200 µg/souris] pendant 18 h. Des cellules NK activées par Poly (I: C) ont été isolées de la rate à l'aide du kit d'isolation de cellules EasySepMouse NK (STEMCELL Technologies). Les cellules NK purifiées ont été co-cultivées avec des cellules cibles dans un rapport de 5:1, 2,5:1 et 1,25:1 en présence d'IL-2 (50 U/ml).

m6A-séq

Les cellules NK spléniques purifiées ont été développées par IL-2 (1,000 U/ml, numéro de catalogue Bulk Ro 23-6019 ; National Cancer Institute) in vitro pendant 7 jours. L'ARN total a été isolé par le réactif TRIzol (Thermo FisherScientific) à partir de 50 millions de cellules NK expansées par IL -2. L'ARN polyadénylé a été enrichi à partir de l'ARN total en utilisant le kit de purification d'ARNm Dynabeads (Invitrogen). Les échantillons d'ARNm ont été fragmentés en fragments de 100- longueurs nt avec des réactifs de fragmentation d'ARN (Invitrogen).

L'ARNm fragmenté (5 µgmARN) a été utilisé pour l'immunoprécipitation de m6A à l'aide d'un anticorps m6A (202003 ; Synaptic) en suivant le protocole standard du kit Magna MeRIP m6A (Merck Millipore). L'ARN a été enrichi via RNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research) pour la génération de bibliothèques avec un kit KAPA RNA HyperPrep (Roche). Le séquençage a été effectué dans les installations de génomique de City of Hope sur une machine Illumina HiSeq 2500 avec mode lecture unique 50- pb. Les lectures de séquençage ont été cartographiées sur le génome de la souris à l'aide du logiciel HISAT2 v101 (Kim et al., 2015).

Des lectures mappées d'immunoprécipitation et de bibliothèques d'entrée ont été fournies à l'aide du package R exomePeak (Meng et al., 2014). Les m6Apeaks ont été visualisés à l'aide du logiciel Integrative Genomics Viewer (//www.igv.org). Le motif de liaison m6A a été analysé par MEME (https://meme-suite.org) et HOMER (//homer.ucsd.edu/homer/motif). Les pics appelés ont été annotés par intersection avec l'architecture des gènes à l'aide du Rpackage ChIPseeker (Yu et al., 2015).

StringTie was used to assess expression levels for mRNAs from input libraries by calculating the total exon fragments/mapped reads in millions × exon length in kb (Pertea et al., 2015). The differentially expressed mRNAs were selected with log2(fold change) >1 oulog2 (changement de pli)<−1 and P < 0.05 using the R package edgeR (Robinson et al., 2010).

Séq. RIP YTHDF2

50 millions de cellules NK expansées par IL-2 ont été récoltées et lavées deux fois avec du PBS froid, et le culot cellulaire a été lysé avec 2 volumes de tampon de lyse (10 mM Hepes, pH 7,6, 150 mM KCl, 2 mM EDTA, 0,5 % NP-40, 0,5 mM dithiothréitol, 1:100 cocktail d'inhibiteurs de protéase [Thermo Fisher Scientific] et 400 U/ml d'inhibiteur de SUPERase-In RNase [Thermo Fisher Scientific]).

Le lysat a été incubé sur de la glace pendant 5 minutes et centrifugé pendant 15 minutes pour clarifier le lysat. Un dixième du volume de lysat cellulaire a été enregistré en entrée. Le reste du lysat cellulaire a été incubé avec 5 µg d'anti-YTHDF2 (numéro de catalogue RN123PW ; MBL) couplé à des billes magnétiques de protéine A (numéro de catalogue 10001D ; Invitrogen). à 4 degrés pendant 2 h avec rotation douce. Ensuite, les billes ont été lavées cinq fois avec 1 ml de tampon de lavage glacé (HEPES 50 mM, pH 7,6, NaCl 200 mM, EDTA 2 mM, NP à 0,05 % -40, dithiothréitol 0,5 mM et 200 U/ml de RNase. inhibiteur).

Les échantillons immunoprécipités ont été soumis à une digestion par la protéinase K dans un tampon de lavage complété avec 1 % de SDS et 2 mg/ml de protéinase K (ThermoFisher Scientific) incubés sous agitation à 1 200 tr/min à 55 degrés pendant 1 h. L'ARN total a été extrait de l'ARN d'entrée et de l'ARN immunoprécipité en ajoutant 5 volumes de réactif TRIzol suivi de Direct-zol RNA Miniprep (Zymo Research).

La bibliothèque d'ADNc a été générée avec un kit KAPA RNA HyperPrep (Roche) et séquencée sur une plateforme Illumina HiSeq 2500. Les résultats d'appel de pointe avec immunoprécipitation et bibliothèques d'entrée ont été générés par le package R RIPSeeker (Li et al., 2013). HOMER a été utilisé pour trouver des motifs de distribution de données dans les régions de pics. Les pics appelés ont été annotés par intersection avec l'architecture des gènes et des transcriptions à l'aide de ChIPpeakAnno (Zhu et al., 2010).

Test de stabilité de l'ARNm

Des cellules NK spléniques purifiées de souris Ythdf2ΔNK et Ythdf2WT ont été cultivées avec de l'IL-15 (50 ng/ml). Trois jours après la culture, les cellules ont été traitées avec de l'actinomycine D (5 µg/ml, n° de catalogue A9415 ; Sigma) pendant la durée indiquée. Les cellules sans traitement ont été utilisées à 0 h. Les cellules ont été collectées au moment indiqué et l'ARN total a été extrait des cellules pour la qPCR. La demi-vie de l'ARNm a été calculée à l'aide de la méthode décrite précédemment par Weng et al. (2018). Les séquences d'amorces sont répertoriées dans le tableau S1.

Analyse de base de données en ligne

Nous avons utilisé la ressource en ligne BioGPS (//biogps.org) pour analyser l'expression spécifique aux tissus de Ythdf2. Les ensembles de données RNA-seqdata provenaient de GEO sous les numéros d'accès. GSE106138, GSE113214 et GSE25672. Les données normalisées des analyses de séquençage d'ARN ont été exportées et le score z de l'expression génique a été visualisé avec la fonction Heatmap.2 dans la bibliothèque gplots Rlibrary.

Statistiques

Les tests t de Student non appariés (bilatéraux) ont été réalisés à l'aide du logiciel GraphPad Prism. Une ANOVA unidirectionnelle ou bidirectionnelle a été réalisée lorsque trois groupes indépendants ou plus étaient comparés. Les valeurs P ont été ajustées pour des comparaisons multiples à l'aide de la procédure Holm-Sˇ´ıdak. P < 0.05 a été considéré comme significatif. *, P < {{10}}.05 ; **, P < 0,01 ; et ***, P <0,001.

Matériel supplémentaire en ligne

La figure S1 montre les niveaux de protéine YTHDF2 dans les cellules immunitaires, y compris les cellules NK en réponse à la stimulation de l'IL-15, à l'infection par le MCMV et à la progression tumorale ; la génération de souris avec une délétion de Ythdf2 spécifique à NKcell. La figure S2 montre les titres viraux dans la rate et le foie de souris infectées par MCMV ainsi que le pourcentage et le nombre absolu de cellules Ly49H+ et/ou Ly49D+ NK chez des souris infectées par MCMV. La figure S3 montre la prolifération, la survie, la maturation et l'expression des récepteurs activateurs et inhibiteurs des cellules NK de souris Ythdf2WT et Ythdf2ΔNK. La figure S4 montre la régulation de l'expression de YTHDF2 par la signalisation IL-15-STAT5 et l'expression des composants des récepteurs IL-15, la voie PI3K – AKT et la voie MEK – ERK dans les cellules NK de Ythdf2WT et Ythdf2ΔNK. souris. La figure S5 montre les tests RNA-seq, m6A-seq et RIP-seq à l'échelle du transcriptome dans les cellules NK. Le tableau S1 répertorie les amorces utilisées dans l'étude.

Disponibilité des données

Les données RNA-seq, m6A-seq et RIP-seq ont été déposées au National Center for Biotechnology Information GEO sous le numéro d'accès. GSE174027. Les données restantes qui soutiennent les conclusions de cette étude sont disponibles sur demande auprès des auteurs correspondants.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (NS106170, AI129582, CA247550, CA163205, CA223400, CA068458 et CA210087), la Leukemia and Lymphoma Society (1364-19), le California Institute for Regenerative Medicine (DISC2COVID{{ 9}}), et le Breast Cancer Alliance 2021 Exceptional ProjectAward. Ce travail a également été partiellement soutenu par un USDAaward (USDA/NIFA 2020-67017-30843).

Contributions des auteurs : S. Ma, J. Yu et MA Caligiur ont conçu et conçu le projet. S. Ma, J. Yan, J. Zhang et J. Yu a réalisé des expériences et/ou des analyses de données. Z. Chen, L.-S.Wang, JC Sun et J. Chen ont fourni des réactifs et du matériel de support. S. Ma, J. Yu, J. Chen et MA Caligiuri ont écrit, révisé et/ou révisé l'article. Tous les auteurs ont discuté des résultats et commenté le manuscrit.

Divulgations : J. Chen a signalé « autre » de Genovel BiotechCorp. en dehors du travail soumis et est l'un des fondateurs scientifiques de Genovel Biotech Corp. et un conseiller scientifique en oncologie raciale. Aucune autre divulgation n'a été rapportée.

Les références

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